METODA COMPUTATIONALA DE ANALIZA CANTITATIVA A HORMONILOR ANDROGENI CU APLICATII IN PROBLEMELE DE CONTROL DOPING

Barbu CHITIMIA, Graziela VAJIALA, Mia LAMOR

Institutul National de Cercetare pentru Sport, Bucuresti

DESCRIEREA PROGRAMULUI

Sistemul computerizat GCMS pe care il utilizam este dotat de firma cu un program de achizitie si prelucrare de date care este in esenta un interpretor de comenzi (firma producatoare il numeste "Command Processor"- Procesor de Comenzi), asemanator in foarte multe privinte cu interpretoarele de tip BASIC.

Aceasta inseamna ca programul ofera o linie de comanda care permite incarcarea si executarea imediata a unor comenzi, fara sa mai fie necesara o faza de compilare a codului. Asemenea interpretoarelor Basic, este posibil sa se scrie si fisiere de comenzi (macrou-ri avand extensia "mac"), care sa fie executate secvential, in mod "batch".

In ceea ce priveste functiile existente in cadrul softului original al firmei furnizoare, aprecierea pe care o putem face este ca, datorita in primul rand faptului ca este vorba de un pachet de programe de utilitate generala, acestea nu ofera toate posibilitatile pe care le solicita un soft dedicat analizei unor probe a caror concentratie se situeaza in multe cazuri aproape de limita de detectie a instrumentului. Lipsesc, de exemplu, mecanismele de executie a transformatei Fourier a datelor, care asigura eliminarea zgomotului prin construirea unor filtre digitale (de obicei filtre care elimina frecventele inalte din datele cromatografice) bazate pe acest tip de prelucrare computationala. De asemenea, nu sunt prezente mecanisme automate de decizie relative la optimalitatea alegerii modelelor pentru curbele de calibrare, softul lasand pe seama operatorului alegerea modelului de curba de calibrare. Aceasta modalitate de selectare este deficitara, deoarece decizia ar trebui bazata pe un estimator numeric al optimalitatii si nu pe aprecierea subiectiva a operatorului uman. 

Exista in plus si alte aspecte oarecum deficitare ale softului furnizat de firma constructoare a instrumentului, de pilda imposibilitatea de a lucra cu fisiere binare, ci numai cu fisiere ASCII, inexistenta unei documentatii privind formatul fisierelor de date, care face ca datele sa nu poata fi exportate in alte programe, de exemplu in formatul JCAMP, adoptat de Comisia Europeana de Spectroscopie, lipsa unor comenzi de control al secventei programelor-ciclurile FOR.. END, REPEAT..UNTIL-, care sunt doar emulabile etc.

Din acest motiv s-a luat decizia de utilizare a unui mediu de programare sub sistemul de operare Windows (95/98), care sa ofere toate facilitatile care lipsesc in produsul original si anume programul Matlab (versiunea 4.2). Acesta este un mediu de programare, dedicat in special calculelor stiintifice, care are posibilitatea de a prelucra cantitati mari de date numerice cu o viteza considerabila, mai ales daca acestea se prezinta sub forma matriciala (acronimul Matlab provine din "Matrix laboratory").

Programul se prezinta sub forma unei interfete grafice, care poseda o bara de comenzi. Caracteristica de baza a softului realizat sub mediul Matlab este ca el integreaza functii generale ale mediului Windows (primele patru elemente prezente in extrema stanga a barei de comenzi) cu functii ale softului original al firmei Hewlett-Packard impreuna cu functii specifice Matlab. In cele ce urmeaza vom descrie pe scurt utilizarea programului pentru construirea curbelor de calibrare si folosirea lor la analiza unei probe necunoscute. Se presupune ca suntem deja in posesia datelor experimentale primare, anume a cromatogramelor unor amestecuri standard de hormoni androgeni de diverse concentratii impreuna cu un standard intern, in cazul de fata D4-etiocolanolon, prezent in toate amestecurile in aceeasi concentratie-500ng/ml-, cromatograme inregistrate in modul de detectie SIM (selected ion monitoring).

• 1. Se lanseaza din bara de comenzi programul Msda ("mass spectrometry data analysis"), care este interfata grafica originala a fimei HP. Msda a fost la randul sau modificat in sensul ca s-au adaugat doua functii noi, scrise in limbajul propriu al procesorului de comenzi HP si anume Integrarea probelor standard (folosite la construirea curbelor de calibrare) si Integrarea probei de analizat. Prima din aceste functii ofera posibilitatea lucrului cu mai multe fisiere de date deodata, spre deosebire de functia corespunzatoare din softul original. Aceasta permite ca, dintr-o singura comanda, sa poata fi procesate toate cromatogramele folosite pentru construirea curbelor de calibrare precum si a probelor replica. Replicile sunt utilizate la estimarea dispersiilor asociate fiecarui punct din curba de calibrare. Toate operatiile de integrare a peak-urilor cromatografice se realizeaza alocand dinamic valoarea parametrului threshold. Acesta este un parametru care furnizeaza operatiei de integrare o valoare (legata de expresia derivatei numerice a curbei cromatografice) folosita la estimarea limitelor de integrare a peak-urilor cromatografice. Din cauza faptului ca valorile concentratiilor substantelor de interes folosite la calibrare variaza intre limite foarte largi (pe trei ordine de marime), stabilirea unei valori corecte a acestui parametru, la integrarea fiecarui peak cromatografic de interes, este o conditie esentiala pentru realizarea unor curbe de calibrare corecte. Stabilirea dinamica a valorii acestui parametru asigura faptul ca nu se pierd la integrare peak-uri esentiale si, pe de alta parte, reduce la minimum numarul peak-urilor-artefact integrate. Pentru ca parametrul threshold sa fie stabilit corect, ion cromatograma este in prealabil netezita dupa algoritmul Savitzky–Golay sau folosind un filtru bazat pe transformata Fourier a semnalului [1,2,3]. Se elimina astfel componentele de inalta frecventa din cromatograma. In acest mod, partea din operatia costruire a curbelor de calibrare care se refera la integrarea, de exemplu, a 21 de ion-cromatograme (7 puncte de calibrare a cate trei replici fiecare- aceasta modalitate de calibrare este cea curent folosita in laborator), care implica extragerea de date din peste 250 de fisiere ASCII dureaza un timp destul de mic, maximum 5 minute.
• 2. Se revine in mediul de programare Matlab, unde prin comanda Calibrate se efectueaza operatia de constructie a curbelor de calibrare si se furnizeaza elementele necesare reprezentarii lor grafice, impreuna cu abaterile standard ale fiecarui punct din curba de calibrare (daca se folosesc mai multe replici). Tehnica folosita este cea cunoscuta sub denumirea "metoda celor mai mici patrate"[ ], aplicata la determinarea curbelor de calibrare exprimate analitic prin polinoame de grad maxim 2. Sunt in curs de elaborare si metode care folosesc functii spline . Timpul de calcul pentru aceasta operatie este practic nesemnificativ, in jur de 3 sec. Curbele de calibrare se pot vizualiza folosind comanda Graphs care afiseaza un meniu derulant de unde se poate selecta curba de calibrare dorita.
• 3. Dupa construirea curbelor de calibrare se poate trece la analiza unei probe necunoscute. Se reia etapa 1, dar se executa de aceasta data functia de integrare a unei probe necunoscute. Dupa revenirea in cadrul interfetei grafice din mediul Matlab lansarea comenzii Analyse determina rezolvarea ecuatiei in x: (1) C(x)=y, unde C(x) reprezinta expresia analitica a curbei de calibrare, iar y valoarea numerica experimentala a integrarii peak-ului cromatografic corespunzator unui anume compus. In mod sistematic, in problemele de control doping se masoara concentratiile a 12 hormoni androgeni. Comanda Analyse determina afisarea pe monitor a unui raport de analiza, care se poate tipari. Acesta contine pe langa valorile calculate ale concentratiilor celor 12 hormoni si alte date (Tabelul 1).

ASUPRA ALEGERII CURBELOR DE CALIBRARE

Softul original HP ofera operatorului 2 posibilitati de alegere a modelului de curba de calibrare si anume sub forma de polinoame de gradul 1(dreapta) si 2 (parabola), cu optiunile de fortare a curbei de a trece prin originea sistemului de coordonate si de ponderare a coeficientilor polinomiali cu inversele valorilor dispersiilor punctelor experimentale (care se pot calcula doar atunci cand pentru fiecare punct se fac mai multe determinari paralele).

Se poate usor argumenta ca aceasta optiune nu este intotdeauna realista. Fortarea curbei de a trece prin origine echivaleaza cu admiterea faptului ca instrumentul poseda sensibilitate infinita, deoarece la orice valoare diferita de 0 a variabilei independente (oricat de mica ar fi) raspunsul instrumentului este masurabil si diferit de 0. Se neglijeaza aici faptul ca in determinarile gaz-cromatografice care folosesc detectia prin spectrometrie de masa exista intotdeauna un "background" (fond) diferit de 0, care forteaza curba de calibrare sa devina mai mult sau mai putin paralela cu axa variabilei independente (axa valorilor de concentratie), spre valorile mici de concentratie. Din aceasta cauza curba de calibrare nu poate fi o dreapta pe intreg domeniul de valori de concentratie. Desigur, locul de unde curba de calibrare incepe sa-si schimbe panta este diferit de la substanta la substanta, definind de fapt limita de sensibilitate a metodei. Aceasta imprejurare ne-a determinat sa luam in considerare si construirea de curbe de calibrare pe domenii de concentratie. Curba generala de calibrare este deci formata din reuniunea curbelor pe diverse domenii, ea avand inca proprietatea de continuitate pe intreg domeniul masurabil de concentratie, fara insa sa se asigure derivabilitatea in punctul de intersectie. Astfel de curbe de calibrare asigura o precizie mai mare a determinarilor. Softul realizat in laboratorul nostru ofera operatorului posibilitatea de alegere a tipului de curba de calibrare si, de asemenea, exista optiunea de selectare automata (optimala) a tipului de curba de calibrare, bazata pe compararea valorilor coeficientilor de determinare.

CALCULUL ERORILOR ASOCIATE DETERMINARILOR EXPERIMENTALE

In orice tip de determinare experimentala, rezultatul obtinut este afectat de erori. In consecinta, este necesar sa existe modalitati de estimare a erorilor de masura. In ceea ce priveste erorile aleatoare, exista o posibilitate de estimare a lor, tinand cont de imprejurarea ca parametrii care caracterizeaza curbele de calibrare (coeficientii polinomiali) sunt inca variabile aleatoare, caracterizate de valori medii, dispersii etc. 

Din lipsa de spatiu nu putem prezenta modul de calcul al erorilor, ci doar rezultatul calculului pentru curbele de ordinul 1.

Dispersia D(x) asociata cu valoarea de concentratie x determinata rezolvand ecuatia (1) este data de expresia(2):

(2) D(x)=D₀*b^-1*{n^-1 + p^-1 + n*(med(yexp)-med(ycal))² /[b²*(n*S(x²)-S(x)²)]}^0.5;

Aici D₀ este dispersia valorilor experimentale rezultate din masuratorile de etalonare, b este panta dreptei de etalonare, n este numarul de etaloane, p este numarul determinarilor paralele efectuate cu aceeasi proba necunoscuta, in conditii identice. Simbolurile med () si S() reprezinta media valorilor posibile ale variabilei din paranteza, respectiv suma lor. Yexp si ycal reprezinta multimea celor p valori experimentale paralele si multimea valorilor experimentale ale determinarilor folosite la etalonare, respectiv.

Din expresia (2) a dispersiei valorii x (care in cazul nostru este o concentratie) se poate stabili un interval de incredere pentru valoarea x, corespunzator unei anumite probabilitati atasate intervalului (de obicei se admite o probabilitate de 0.95), conform procedurilor standard [4]. 

Se poate lesne observa ca dispersia este cu atat mai mica cu cat b este mai mare. Acesta este motivul pentru care se prefera actualmente folosirea ca substanta de referinta a d4-etiocolanolonului in loc de metil-testosteron [5]. De asemenea, dispersia scade cu cresterea numarului de etaloane si a numarului de determinari paralele. Termenul al 3-lea din expresia 2 exprima faptul ca dispersia se micsoreaza daca valorile experimentale obtinute sunt in jurul valorii med (ycal), putand sa fie chiar 0. De aici se deduce ca erorile experimentale nu sunt constante pe intreg intervalul valorilor x. Ele sunt inevitabil mai mari spre capetele intervalului.

CONCLUZII

Programul pe care l-am descris pe scurt - aflat la a 5-a versiune-, permite construirea rapida a curbelor de calibrare pentru determinarea hormonilor androgeni si determinarea concentratiilor acestor compusi in probe necunoscute. Intreg procesul, pornind de la calibrare pana la tiparirea rezultatelor dureaza maximum 10 minute. Exista posibilitatea de a se estima erorile de masura( conditie necesara pentru ca o metoda analitica sa indeplineasca standardul "Good laboratory practice") [6], lucru indispensabil in situatiile in care decizia de considerare a unei probe drept pozitive sau nu este determinata de valoarea numerica a unui parametru, considerat "critic". Un astfel de parametru este de pilda raportul T/E (testosteron/epitestosteron), valoarea critica fiind 6 [7]. O valoare de peste 6 a acestui raport determina analize suplimentare a probei, din acest motiv calculul erorilor de masura in aceste cazuri "limita "este un lucru obligatoriu. Versiunea viitoare a softului, va permite modificarea rapida a datelor de intrare, in scopul realizarii analizei oricarui compus. Acest lucru este posibil si in versiunea actuala, insa implica cunoasterea amanuntita a codului, modificarile in soft, minore de altfel, trebuind sa fie operate doar de autorii programului.

BIBLIOGRAFIE

[1] Donogue, W., Distributions and Fourier transform, New York, Academic Press,  1969.

[2] Huber, L., Recent Advances in Doping Analysis(3), Koeln, Sport und Buch Strauss, 1996, p.299.

[3] Jenkins, G. M., Watts, D.G., Spectral Analysis and its Applications, San Francisco, Holden-Day, 1970.

[4] Liteanu, C., Rica, I., Optimizarea proceselor analitice, Bucuresti, Editura Academiei, 1985, p.111.

[5] Nolteersting, E, et alt., Recent Advances in Doping Analysis(2), Koeln, Sport und Buch Strauss, 1995, p.113.

[6] Savitzky, A., Golay, M.J.E., Analyt. Chem., 36, 1627 (1964).

[7] Schaentzer, W., Donike, M., Recent Advances in Doping Analysis(3), Koeln, Sport und Buch Strauss, 1996, p.93.

ABSTRACT

COMPUTATIONAL METHOD FOR THE QUANTITATIVE ANALYSIS OF THE ANDROGENOUS HORMONES WITH APPLICATION TO THE DOPING CONTROL CONCERNS

 This paper describes a quantitative analysis program of the androgenous hormones, using experimental data obtained by the gas chromatography, coupled to the mass-spectrometry (GC/MS). The program is written under the programming system Matlab (version 4.2), Windows compatible. The program has a character of "dedicated program", this meaning that, on the one hand, it uses commands which are specific to the instrument used to obtain the primary experimental data (a chromatographic gas, model 6890, coupled to a quadripolar selective mass detector, model 5972 A, created by Hewlett Packard) and, on the other hand, program modules written in the Matlab language, which offer to the programmer a strong computational support. The program elaboration strategy consists in its modulation, the majority of the modules being independent hardware. Estimated formulae are presented for the errors associated to the experimental data.

.