METODE DE CALIBRARE FOLOSITE IN DETERMINARILE CANTITATIVE DE SUBSTANTE DOPANTE

Barbu Chitimia, Graziela Vajiala, Mia Lamor

Institutul National de Cercetare pentru Sport, Bucuresti

Introducere

Prezenta lucrare este o continuare a celei sustinute anterior [1]. Aceasta se referea la descrierea succinta a unui software utilizat pentru determinarea cantitativa a hormonilor androgeni, in probe de urina, prin tehnica gaz cromatografica cuplata cu spectrometria de masa, procedeu folosit in controlul doping al sportivilor.

Fata de programul original al firmei furnizoare a instrumentului cu care se fac determinarile de tipul mentionat mai sus, programul realizat in cadrul Laboratorului de Control Doping al INCS prezenta avantajul posibilitatii de a se calcula erorile care intervin in procesele de masurare, lucru important atunci cand se determina compusi pentru care exista concentratii maxime admisibile, stabilite de comisia de specialitate din cadrul C.I.O. De asemenea, metoda de construire a curbelor de etalonare folosea un procedeu relativ nou de aplicare a metodei celor mai mici patrate, mai precis o tehnica de minimizare a functiei obiectiv, utilizand drept ponderi asociate punctelor de calibrare valori invers proportionale cu dispersiile acestora.

Pe de alta parte, necesitatea de a elabora metode de masura care sa fie conforme cu cerintele in domeniu ale standardului european ISO 17025, ne-a determinat sa luam in considerare standardele germane DIN 32645 si DIN 38402, care se refera la principiile de construire a curbelor de calibrare si mai ales la metodele numerice de apreciere a erorilor de masura. Aceste standarde sunt folosite de Laboratorul de Control Doping din Koln, acreditat de C.I.O.

Lucrarea de fata tine cont de cerintele expuse in standardele germane mentionate si, in plus, propune utilizarea functiilor spline pentru construirea curbelor de calibrare, precum si o procedura relativ simpla de compensare a deplasarii timpilor de retentie, ca functie de numarul de injectii in coloana cromatografica. Consecinta imediata a acestui din urma lucru, in fapt o metoda de "locking" a timpilor de retentie, este ca probabilitatea ca programul faca erori de atribuire a peak-urilor cromatografice a scazut semnificativ, fiind apreciata a fi in jur de 0.5%. Noul software contine, de asemenea, si procedura standard de masurare a raportului testosteron/epitestosteron.

1.Metoda de "locking" a timpilor de retentie in determinarile de gaz cromatografie, cuplata cu spectrometria de masa.

Esenta identificarii substantelor separate cromatografic, indiferent de tehnica particulara folosita

- gaz cromatografie sau HPLC- rezida in supozitia ca, in conditii bine precizate privind natura substantelor de separat, tipul de coloana capilara folosita, inclusiv lungimea ei, programul de temperatura utilizat pentru separare, eventual tipul de derivatizare chimica a produsilor de interes, timpii de retentie ai compusilor separati pe coloana sunt marimi constante. In realitate, din motive legate in special de impurificarea substantei active a coloanei cu componente ale probelor de analizat, (care pot ramane permanent in coloana) si datorita unui proces lent de eluare a componentei active a coloanei de catre solventii utilizati la introducerea probelor si de catre gazul purtator (din motive de protectie la procese de oxidare a substantei active a coloanei si mai ales de protejare a sistemului de detectie, coloana este permanent refluxata cu gazul purtator), timpii de retentie prezinta un drift temporal, spre valori mai mici. Aceasta este echivalent cu scaderea numarului de talere teoretice ale coloanei, altfel spus, cu scaderea eficientei ei. Din experienta noastra, variatia timpilor de retentie poate atinge, in cazul unei coloane ajunse la sfarsitul ciclului de utilizare (o coloana suporta in medie cam 1000 de injectii, incluzand standardele, matricile de control si probele de masurat), valori in jur de 1 min. Acest drift este enorm, tinand cont ca majoritatea substantelor vehiculate in coloana au semilargimi ale peak-lui in jur de 3 sec.

Figura 1. Peak cromatografic corespunzator unei coloane uzate

Figura 2. Peak cromatografic corespunzator unei coloane noi

O astfel de situatie este prezentata in fig. 1 si 2, unde este ilustrata ion cromatograma standardului intern folosit uzual la determinarile de hormoni androgeni, d4-etiocolanolon.

In cazul probei ha301, injectata intr-o coloana care se gaseste aproape de limita de utilizare, timpul de retentie este de 13.28 minute, in timp ce in cazul probei sa301, absolut identica cu ha301, injectata intr-o coloana relativ noua, timpul de retentie este 14.21 min. Scaderea timpilor de retentie in functie de numarul de injectii este un fapt explicabil: componenta activa a coloanei, din cauza degradarii chimice, este mult mai putin capabila sa mai retina prin dizolvare substantele de analizat, acestea tinzand sa persiste mai degraba in gazul purtator si sa se elueze, in consecinta mai repede. Se poate observa si o micsorare importanta a suprafetei peak-lui cromatografic in cazul probei ha301, adica a sensibilitatii, insa acest fapt se poate datora si sistemului de detectie.

Totusi, cu toate ca timpii de retentie absoluti prezinta drifturi atat de mari, ceea ce exclude identificarea automata bazata pe supozitia constantei lor, o examinare exhaustiva a timpilor de retentie relativi, raportati la cei ai standardului intern, de pilda, arata ca acestia se mentin constanti in limite rezonabile. In consecinta, programul de detectie a peak-urilor cromatografice a fost schimbat astfel: se detecteaza pozitia peak-ului ionului 438, intotdeauna prezent in proba, provenind de la standardul intern d4-etiocolanolon. Pe baza unui tabel, care contine timpii de retentie ai compusilor de interes fata de d4-etiocolanolon, construit prin folosirea datelor inregistrate anterior, sunt identificati pe rand ionii cu numerele de masa 526, 435, 301, corespunzatori unor standarde deuterate, prezente obligatoriu in probele de analizat si metil-testosteronului, standard intern nedeuterat. Singura dificultate posibila poate aparea la analiza ionului cu m/z=435, deoarece acesta apartine deopotriva d3-epitestosteronului, d3-testosteronului si apare, din cauza unui efect izotopic de inlocuire a C12 cu C13 si in peak-ul hormonilor citati (coelueaza cu acestia), nedeuterati. Pe langa seria de timpi de retentie relativi fata de d4-etiocolanolon, s-au elaborat tabele "secundare" de identificare, referitoare la d4-11-beta-OH-androsteron, metil-testosteron si d3-testosteron. Din coroborarea datelor obtinute folosind tabela principala a timpilor de retentie cu rezultatele derivate din folosirea tabelelor secundare, apare un sistem logic de relatii, in marea majoritate a cazurilor redundant, care permite o atribuire robusta a peak-urilor cromatografice. Fiecarui peak i se poate atasa o "cifra de merit" (care este probabilitatea valorii de adevar a inferentei emise asupra naturii peak-lui), exprimata procentual. Pentru valori ale cifrei de merit mai mici de 90%, sistemul emite o atentionare asupra acestei imprejurari.

2.Functii de calibrare utilizate in determinarile gaz cromatografice.

Problema construirii curbelor (functiilor) de calibrare, pentru un sistem de detectie, indiferent de natura lui, este reductibila, din punct de vedere matematic, la urmatoarele:

fiind dat un sir monoton crescator x_i, i=1,2…n, de n numere (acesta ar putea reprezenta, de exemplu, sirul concentratiilor de calibrare) si un sir de valori, y_i, reprezentand "raspunsul" unui sistem de detectie corespunzator sirului x_i , se cere sa se gaseasca functia f() pentru care f(x_i)=y_i.(1). Aceasta problema face parte din clasa "problemelor rau puse", in sensul atribuit de J. Hadammard, intrucat, fara restrictii puternice asupra lui f (), solutia nu este unica. Chiar si in cazul in care f () este o functie continua si aleasa si mai restrictiv, din clasa polinoamelor, solutia este inca indefinit determinata. Este, de pilda, cunoscuta de mult constructia polinomului Lagrange de grad (n-1) care satisface exact relatia (1). Insa acest polinom prezinta „ondulatii" nepermis de mari, ceea ce face ca polinomul Lagrange sa nu poata fi utilizat la constructia unei curbe de calibrare. Curba de calibrare (expresia ei analitica) trebuie sa fie o functie strict monotona (mai general, injectiva), cel putin pe intervalul de valorilor de calibrare, pentru ca solutia ecuatiei (1), inteleasa ca valabila pentru orice punct din domeniul de calibrare, sa fie unica. Revenind la solutia polinomiala a ecuatiei (1), precizia nu poate fi imbunatatita prin „indesirea" valorilor de calibrare, ondulatiile functiei de calibrare nereducandu-se obligatoriu. Pot fi aici citate exemplele gasite de Kuta si Bernstein [2]care arata ca, in anumite cazuri, cu cresterea la infinit a numarului elementelor sirului x_i, ondulatiile lui f () nu se reduc, ci tind chiar la infinit.

In sfarsit, poate fi aici amintita teorema lui Faber, cu caracter negativ, care arata in esenta ca polinomul este o functie mai mult decat nepotrivita pentru interpolarea functiilor.

Standardele germane mentionate recomanda urmatorul algoritm de construire a curbei de calibrare[3,4]:

1. Trebuie verificata mai intai omogenitatea variantei asociate fiecarui punct de calibrare. Pentru ca statistica sa fie semnificativa, este necesar ca numarul de replici pentru fiecare punct sa fie minim 10.
2. Deoarece este imposibil, chiar in cazul ca numarul replicilor este mult mai mare, sa obtinen aceeasi varianta pentru toate punctele de calibrare, se utilizeaza testul statistic F, pentru a se vedea daca diferentele intre valorile numerice ale variantelor calculate in fiecare punct de calibrare sunt semnificative sau nu. In caz ca se constata diferente consistente statistic, se reduce numarul punctelor de calibrare. De obicei, punctele care nu respecta conditia de omogenitate a variantei, sunt cele marginale. Acest fapt inseamna ca inevitabil suntem obligati sa reducem plaja de valori pentru care putem exprima rezultate ale analizei asociate si cu erorile de masura.
3. Cu datele experimentale validate de testul F, se construieste curba de calibrare, pornind de la expresia cea mai simpla: curba de gradul 1. In majoritatea cazurilor aceasta se construieste folosind metoda celor mai mici patrate. Software-ul prezentat in lucrarea precedenta utiliza aceasta tehnica admitand ca variantele fiecarui punct de calibrare pot fi diferite si atribuind fiecarui punct folosit la constructia curbei de calibrare ponderi (normate intre valoarea 0 si 1) invers proportionale cu varianta asociata lui. Cu alte cuvinte, punctele cu varianta mare, considerate a fi mai putin "sigure" decat celelalte, joaca un rol mai putin important in stabilirea parametrilor curbei de calibrare, prin ponderile mici asociate. Insa, in cazul in care, de la inceput, se selecteaza doar puncte de varianta egala, utilizarea ponderilor este superflua si, in consecinta, programul a fost modificat in acest sens.
4. Obtinerea parametrilor curbei de calibrare, adica a pantei si a ordonatei punctului de zero nu insemna decat ca s-a obtinut o curba de calibrare "candidat". Ea trebuie validata de un test de linearitate, care este tot un test de tip F. Acesta furnizeaza informatii privitoare la masura in care punctele experimentale care nu se situeaza pe curba (in constructia curbei de calibrare bazata pe metoda celor mai mici patrate, acest lucru este frecvent) sunt totusi semnificativ de "apropiate" de curba de calibrare.
5. Daca testul de linearitate esueaza, se trece la considerarea unor curbe de ordin superior (parabola sau curbe de gradul 3). Pentru aceste cazuri se parcurge acelasi algoritm de validare.

Problemele care pot aparea in practica sunt urmatoarele: testele de linearitate indica faptul ca functiile de calibrare–candidat nu pot fi acceptate, chiar daca variantele calculate trec testul F. In aceste cazuri, erorile calculate sunt mari, iar lucrul acesta se intampla din cauza ca testele de semnificatie au fost trecute " la limita " .

Solutia pe care o propunem este utilizarea la calibrare a functiilor spline [5]. Acestea sunt functii polinomiale pe portiuni ("piecewise polinomials" este termenul din literatura engleza), racordate in punctele de taiere, impreuna cu un numar de derivate. Diferenta fata de polinoamele obisnuite este substantiala. Este demonstrat faptul ca functiile spline cubice sunt unicele functii care minimizeaza un anumit tip de functionala, ce poate functiona ca functie distanta in spatiul functiilor de clasa C^m (clasa functiilor continue, impreuna cu primele m derivate). Cu alte cuvinte, functiile spline cubice sunt cele mai bune functii care pot fi folosite in probleme de interpolare, deoarece global minimizeaza erorile, chiar si in afara punctelor de calibrare.

Prezentam in continuare rezultate preliminare privind calibrarea prin functii spline. Sunt posibile doua abordari si anume: prima se refera la interpolarea datelor, cu alte cuvinte se cere obligatoriu ca functia sa treaca prin punctele folosite la calibrare, a doua, care ni se pare mai apropiata de sensul statistic care trebuie atribuit procesului de masurare, cere ca, in functie de un parametru de netezire convenabil ales, sa minimizeze o functie "distanta", pe tot domeniul valorilor de calibrare. Primul tip de abordare are eroare zero in punctele de calibrare si valori sigur diferite de zero in alte puncte, in timp ce al doilea tip de abordare acorda o egala importanta si valorilor altele decat cele de calibrare, realizand cea mai buna aproximare posibila, cu datele de care dispunem. In figurile 3,4,5,6 sunt infatisate curbele de calibrare, pentru hormonul testosteron, construite tinand cont de diverse tipuri de ipoteze initiale, impreuna cu graficele erorilor calculate in punctele de calibrare. Se poate observa ca erorile cele mai mici le prezinta curba de calibrare din fig. 4, la un grad de ondulatie acceptabil.

Figura 3 Curba de calibrare 'normala', liniara, metoda c.m.m.p.

Figura 4 Curba de calibrare 'netezita'cu cubic spline

Figura 5 Curba de calibrare interpolata cu cubic spline

Figura 6 Curba de calibrare parabolica, metoda c.m.m.p.

Bibliografie

1. Chitimia, B., Vajiala, G., Lamor, M., Metoda computationala de analiza cantitativa a hormonilor androgeni cu aplicatii in problemele de control doping. in: "Sport Curat", Bucuresti, p.72, 2001

2. Micula, Gh., Functii spline. Ed. Tehnica, Bucuresti, 1978, p.12

3. DIN 38402, part 51, Calibration of analytical methods, evaluation of analytical results and linear calibration functions used to determine the performance characteristics of analytical metods. Beuth Verlag GmbH, Berlin, 1986

4. DIN 32645, Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze. Beuth Verlag GmbH, Berlin, 1994

5. Karlin, S., Michell, C.A., Pinkus, A., Schoenberg, I.J., Studies in spline functions and approximation theory. Academic Press, New York, 1976