SEPARAREA EFEDRINEI SI PSEUDOEFEDRINEI PRIN TEHNICA CROMATOGRAFIEI DE GAZ SI A SPECTROMETRIEI DE MASA

Ruxandra Subasu, Georgeta Bican, Graziela Vajiala, Mia Lamor

Institutul National de Cercetare pentru Sport

Introducere

Utilizarea frecventa a stimulentelor in sportul de performanta impune efectuarea controlului doping pentru aceste substante.

Existenta efedrinei si pseudoefedrinei in diferite preparate medicamentoase, frecvent utilizate in tratamentul racelilor, face ca aceste substante sa fie prezente in probele de control doping; acest fapt impune pe de o parte informarea corecta a riscurilor utilizarii acestora pentru sportivii de performanta, dar si punerea la punct a metodologiei de identificare si separare a acestor compusi precum si a metodologiei de cuantificare a substantelor cu limita de determinare cantitativa.

Molecula efedrinei contine doi atomi de carbon asimetrici; ea apare sub forma a doi racemici, efedrina si pseudoefedrina si a patru izomeri optic activi (diastereoizomeri). In figura 1 prezentam structura chimica a efedrinei si pseudoefedrinei [1].

Date experimentale

Material si metode. Standardul de efedrina hidroclorica s-a procurat de la Sigma, USA, din care s-a preparat o solutie de 5mg/ml, standardul de pseudoefedrina de la NARL, Australia, s-a utilizat o solutie de 2,5mg/ml si standard intern (SI), metilefedrina in solutie de 1mg/ml.

Pregatirea amestecului de standarde. S-a preparat un amestec de standarde de concentratii 10g/ml efedrina, 25g/ml pseudoefedrina si standard intern (SI), 4g/ml metilefedrina [2].

Derivatizarea probelor. Amestecul de cercetat s-a derivatizat cu 100l MSTFA timp de 10min. la 80ºC.

Parametrii GC/MS. Extractul biologic a fost analizat cu sistemul computerizat Hewlett Packard GC6890/MS5972 in modul SCAN. Energia de ionizare 70eV. Coloana capilara Ultra 1, 17m lungime. Volumul de injectie 1l, fara splitare. Gazul purtator Heliu, debit 0,8ml/min. Temperatura injectorului si a interfetei 300ºC.

Programul de temperatura: 110ºC, 0,5min., 6ºC/min., 148ºC, 60⁰C/min., 310ºC, 2min [2].

Rezultate si discutii

Datorita structurii chimice, evidentierea si separarea efedrinei si pseudoefedrinei este dificila. Metoda prezentata include, ca etapa premergatoare analizei GC/MS, derivatizarea compusilor de cercetat. Compusii au fost derivatizati cu MSTFA, N-metil-N–trimetilsililtrifluoracetamida la temperatura de 80ºC timp de 10 minute.

In aceste conditii s-a realizat o buna separare a celor doi compusi, identificandu-se derivatii trimetilsililati ai efedrinei si pseudoefedrinei la timpi de retentie diferiti, t_R:5,78 pentru efedrina si t_R:5,94 pentru pseudoefedrina si cu urmatoarele fragmente de masa caracteristice, m/z: 130, 73, 294. Standardul intern, metilefedrina a fost identificat la timpul de retentie t_R: 3,86 avand urmatoarele fragmente de masa caracteristice, m/z: 72, 130, 116 (Figura 2).

Figura 2. Cromatograma totala de ioni si spectrul de masa (EI) pentru efedrina si pseudoefedrina

Metodologia propusa de cercetatorii Laboratorului de Control Doping permite determinarea cantitativa a efedrinei si pseudoefedrinei in probele de control doping conform cerintelor regulamentului Comitetului International Olimpic. Concentratiile de la care o proba este considerata pozitiva sunt de 10g/ml pentru efedrina si 25g/ml pentru pseudoefedrina [3,4].

Cuantificarea efedrinei si pseudoefedrinei s-a realizat utilizand sistemul GC/MS, modul SIM si metoda curbei de calibrare prin regresie liniara. In tabelul 1 sunt prezentate concentratiile efedrinei si pseudoefedrinei utilizate pentru construirea curbelor de calibrare. Mentionam ca la fiecare esantion s-a adaugat 4g/ml de standard intern (SI) [3,4]. 

Tabelul 1. Valorile concentratiilor de efedrina si pseudoefedrina utilizate pentru construirea curbelor de calibrare

Nr.crt. Amestec standarde Conc. efedrina Conc. pseudoefedrina 1. 5g/ml 20g/ml 2. 7g/ml 22g/ml 3. 8g/ml 23g/ml 4. 9g/ml 24g/ml 5. 10g/ml 25g/ml 6. 11g/ml 26g/ml

Curbele de calibrare s-au construit incluzand valoarea critica de determinat si valori in jurul concentratiei de determinat, dar cu preponderenta valori mai mici fata de limita cantitativa de determinat. Intrucat se stie ca erorile de masura sunt mai mari la capetele curbei de calibrare, ar trebui ca valoarea critica a concentratiei probei de determinat sa fie plasata aproximativ in centrul seriei concentratiilor folosite la curba de calibrare. Pe de alta parte, deoarece curba de calibrare s-a construit folosind metoda celor mai mici patrate, cu ponderi invers proportionale cu abaterile standard ale punctelor de calibrare (au fost folosite pentru fiecare punct cate trei replici), s-a preferat o alegere a punctelor de calibrare situate asimetric sub concentratia critica, pentru o evaluare robusta a erorilor induse de punctele care reprezinta concentratiile mici. In figurile 3,4 prezentam curbele de calibrare pentru efedrina, respectiv pseudoefedrina [5].

Figura 3. Curba de calibrare pentru efedrina

Figura 4. Curba de calibrare pentru pseudoefedrina

Concluzii

• Utilizarea tehnicii gaz-cromatografice cuplate cu spectrometria de masa in conditiile prezentate permite identificarea efedrinei si pseudoefedrinei prin realizarea unei bune separari a celor doi izomeri.
• Metodologia prezentata de cuantificare a efedrinei si pseudoefedrinei in probele biologice de urina permite determinarea celor doua substante la limita concentratiilor admise.

 Bibliografie

1. Analytical report reaccreditation test. Institute of Doping Analysis and Sports Biochemistry Kreischa.

2. Donike, M., Dope analysis. International Athletic Foundation World Symposium on Doping in Sport, Florence, 10-12 May, 1987.

3. Nalimov,V.V., The application of mathematical statistics to chemical analysis. Oxford – London – Paris – Frankfurt, Pergamon Press, 1963.

4. Prohibited classes of substances and prohibited methods 2001-2002. Anti-Doping Convention.

Stroescu, V., Bazele farmacologice ale practicii medicale. Vol.1, Ed. Medicala, 1984.