CONFIRMAREA NANDROLONULUI IN CONTROLUL DOPING PRIN TEHNICA CROMATOGRAFIEI DE GAZ CUPLATA CU SPECTROMETRIA DE MASA

Graziela Vajiala, Mia Lamor, Ileana Vajiala, Valentin Pop, Barbu Chitimia

Institutul National de Cercetare pentru Sport

Introducere

Conform statisticilor prezentate de laboratoarele acreditate de CIO, nandrolonul (19-nortestosteron sau 19-nor-4-androsten-3-ona-17-ol) este unul din steroizii anabolici androgeni cei mai frecvent intalniti in probele de control doping. Principalul metabolit al nandrolonului este 19-norandrosteronul (Figura 1). Acesta poate sa apara in organism ca urmare a administrarii preparatelor medicamentoase care contin nandrolon sau a suplimentelor nutritionale contaminate cu hormoni si/sau precursori hormonali. De asemenea, se poate forma in organism, in cantitati mici, din surse endogene sau din utilizarea anticonceptionalelor de tipul noretisteronului, caz in care se va verifica prezenta tetrahidro-noretisteronului. Figura 1. Schema de metabolizare a nandrolonului.

Conform listei publicate de Comisia Medicala a CIO, rezultatul testului este considerat pozitiv pentru o concentratie a 19-norandrosteronului care depaseste 2ng/ml la barbati si 5ng/ml la femei. In cazul femeilor, trebuie tinut cont ca nivelul de norandrosteron poate creste in perioada graviditatii [1].

Prezenta lucrare isi propune cuantificarea 19-norandrosteronului prin tehnica cromatografiei de gaz cuplata cu spectrometria de masa (GS/MS), in baza criteriilor stabilite de documentul elaborat de CIO, august 1998, privind raportarea concentratiilor scazute de steroizi anabolici.

Materiale si metode

Prepararea probelor

Probele de urina au fost preparate in vederea extractiei metabolitilor nandrolonului in acord cu procedura IV pentru steroizi anabolici androgeni, fractii combinate [2].

Probele negative certificate sunt probe de urina care au fost analizate prin GC/MS si in care nu s-a evidentiat prezenta 19-norandrosteronului.

Probele pozitive pe nandrolon s-au obtinut din urine negative in care s-a adaugat 19-norandrosteron in concentratie de 8ng/ml proba.

Probele de referinta certificate s-au obtinut din urine negative in care s-a adaugat 19-norandrosteron in concentratie de 2ng/ml proba.

Standardul de norandrosteron a fost procurat de la Laboratorul National de Standarde Analitice din Australia (NARL). S-a preparat o solutie stoc de 10g/ml. Solutia de lucru s-a obtinut prin diluare de 10ori a solutiei stoc si are concentratia de 1g/ml.

Ca standard intern a fost utilizat d₄-19-norandrosteronul de la NARL si s-a preparat o solutie stoc in concentratie de 10g/ml. Solutia de lucru s-a obtinut prin diluare de 10 ori a solutiei stoc si are concentratia de 1g/ml. Din solutia de lucru a standardului intern, s-a adaugat 25l in fiecare esantion de proba, adica 5ng/ml proba.

Derivatizarea:

Reziduurile uscate in vid pe P₂O₅/KOH au fost derivatizate cu 100l din amestecul de derivatizare MSTFA:NH₄I:etantiol (1000:2:3) si incalzite 15min la 60C. 3l din proba derivatizata s-au injectat in GC/MS.

Parametrii GC/MS:

Instrument: GC/MSD HP 6890/5972.

Coloana: HP Ultra1, lungime 17m, diametru intern 200m, grosime film 0,11m.

Gaz purtator: Heliu 0,8ml/min, injectie split 1:10.

Temperatura injector: 300C.

Program temperatura: 160C (2min), 5C/min – 255C, 30C/min – 285C (5min),

60C/min – 300C (3,75min).

Achizitie MS: - modul SCAN pentru stabilirea timpului de retentie si a spectrului de masa al 19-norandrosteronului,

• - modul SIM pentru cuantificarea 19-norandrosteronului, ionii monitorizati m/z 405, 315, 420 (19-norandrosteron), 409, 424 (d₄-19-norandrosteron),
• - dwell time 100ms (1,72 cicluri/s).

Rezultate si discutii

Pe baza analizei screening in modul SCAN, s-au stabilit parametrii caracteristici pentru identificarea 19-norandrosteronului, care sunt: timpul de retentie (t_R), timpul de retentie relativ (t_RR) si spectrul de masa caracteristic. In conditiile noastre de lucru, utilizand parametrii GC/MS mentionati, t_R este de 12,95min, t_RR fata de standardul intern are valoarea 1,002, iar fragmentele de masa caracteristice 19-norandrosteronului sunt m/z: 405 (pic de baza), 315 si 420 (ion molecular) [3].

In cazul in care, in urma analizei screening, o proba este suspecta pe nandrolon, rezultatul trebuie confirmat prin determinarea cantitatii de 19-norandrosteron [4].

In vederea dozarii 19-norandrosteronului, pe baza parametrilor caracteristici selectati in urma analizei in modul SCAN, s-a creat o metoda de confirmare a acestui metabolit prin GC/MS in modul SIM. Metoda utilizata a fost a curbei de calibrare de regresie lineara cu standard intern deuterat.

Pentru realizarea curbei de calibrare pe domeniul 2-20ng/ml (Figura 2), din solutia de lucru de 1l/ml 19-norandrosteron s-au pipetat cate 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100μl, corespunzator nivelelor de calibrare 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20ng/ml proba. S-au obtinut o curba liniara avand coeficientul de corelatie r = 0,999.

Figura 2. Curba de calibrare pentru 19-norandrosteron.

Aceasta metoda de cuantificare a 19-norandrosteronului va fi utilizata in analiza doping, in scopul confirmarii nandrolonului in probele biologice.

In scopul verificarii metodei de confirmare prezentate in lucrare, s-a analizat, dupa procedeul prezentat, o urina negativa la care s-a adaugat 19-norandrosteron in concentratie de 8ng/ml proba. In figura 3 prezentam rezultatul analizei probei.

Dupa cum se poate observa, din cele 8ng/ml adaugate la proba, prin metoda prezentata in aceasta lucrare, s-au dozat 7,45ng/ml, coeficientul de recuperare fiind foarte bun, de 93,13%.

In cazul confirmarii se recomanda ca proba suspecta sa fie analizata impreuna cu o urina negativa certificata si o urina de referinta certificata. Pentru confirmarea probei, se recomanda urmatoarea succesiune a injectarii in instrumentul analitic [4,5]:

Figura 3. Dozarea 19-norandrosteronului intr-o proba de urina negativa la care s-au adaugat 8ng/ml 19-norandrosteron.

- blanc de reactivi, daca este pertinent;

- urina negativa certificata;

- proba suspecta de confirmat;

- urina negativa certificata;

- urina de referinta certificata.

Prin metoda confirmarii se vor monitoriza cel putin 3 ioni. Raportul semnal/zgomot al ionilor de diagnostic sa fie egal sau mai mare de 3:1.

Pentru ca proba suspecta sa fie declarata pozitiva, trebuie ca t_R sau t_RR al 19-norandrosteronului sa nu difere cu mai mult de 1% fata de timpul lui de retentie din analiza urinei de referinta certificata.

De asemenea, abundenta relativa a oricarui ion monitorizat, nu va diferi cu mai mult de 5% fata de abundenta ionilor corespunzatori din proba de referinta certificata.

Daca aceste criterii sunt indeplinite, proba suspecta va fi declarata pozitiva daca ariile ionilor monitorizati din proba suspecta sunt mai mari decat ariile ionilor corespunzatori din urina de referinta. In cazul probelor provenind de la subiecti de sex feminin, unde concentratia maxima admisa este de 5ng/ml, proba suspecta va fi declarata pozitiva daca ariile ionilor monitorizati din proba suspecta sunt de 2,5 ori mai mari decat ariile ionilor corespunzatori din urina de referinta (concentratie 19-norandrosteron: 2ng/ml).

In cazul in care proba biologica de urina va prezenta o densitate mai mare de 1,020, este obligatoriu sa se faca corectia de densitate [6] pentru a obtine cantitatea corecta de 19-norandrosteron. Corectia se face prin inmultirea rezultatului cu 0,02/(gr.specif.-1).

Concluzii

1. Metoda prezentata permite confirmarea nandrolonului in probele biologice la concentratii foarte joase, coeficientul de recuperare a substantei analizate fiind de 93,13%.

2. O proba nu poate fi declarata pozitiva pe nandrolon atunci cand:

- cand ariile ionilor monitorizati din proba suspecta sunt mai mici decat ariile ionilor corespunzatori din urina de referinta (concentratie 19-norandrosteron: 2ng/ml);
- abundenta relativa a oricaruia dintre ionii monitorizati in proba suspecta va diferi cu mai mult de 5% fata de cea a ionului corespunzator din urina de referinta (concentratie 19-norandrosteron: 2ng/ml).

3. In cazul probelor provenind de la subiecti de sex feminin, proba va fi declarata pozitiva pe nandrolon numai dupa testul de graviditate si verificarea prezentei tetrahidronoretiste-ronului.

Bibliografie

Analytical criteria for reporting low concentration of anabolic steroids, document CIO, august 1998.

Lamor, M., Vajiala, G., Mihailescu, R., Investigarea metabolitilor urinari ai nandrolonului prin GC/MS, Conferinta Stiintifica Internationala, in vol.: „Mutatii in sportul de performanta la sfarsit de secol XX", Bucuresti, p.129-134, 1997.

Mareck-Engelke U., Geyer H., Schänzer W., 19-norandrosterone - Criteria for the decision making process, Recent Advances in Doping Analysis (6), Sport und Buch Strauß, Koln, p.119-131, 1998.

LeBizec B., Gaudin J., Pohn A., Monteau F., André F., Identification of endogenous 19-norandrosteron in human urine, Recent Advances in Doping Analysis (7), Sport und Buch Strauß, Koln, 1999, p.109-121.

New reference list of prohibited pharmacological classes of doping agents and doping methods, Conventia Antidoping din cadrul Consiliului Europei, Strasbourg, 14 august 2001.

Vajiala, G., Lamor, M., Mihailescu, R., Evolutia metodelor analitice pentru detectia substantelor dopante in probele biologice de urina, Sesiunea anuala de comunicari stiintifice, ANEFS, Bucuresti, 4-6 martie, p.345-350, 1999.