DETECTIA FUROSEMIDULUI IN URINA UMANA PRIN CROMATOGRAFIA DE GAZ SI SPECTROMETRIA DE MASA

Georgeta Bican, Ruxandra Subasu, Graziela Vajiala, Mia Lamor

Institutul National de Cercetare pentru Sport

Introducere

Diureticele sunt folosite pe scara larga in terapia hipertensiunii si a edemelor care rezulta ca urmare a problemelor cardiace si renale. Aceste medicamente determina de regula cresterea volumului de urina excretat.

In sportul de performanta, s-a constatat utilizarea tot mai frecventa a diureticelor in sporturile care reclama categorii de greutate pentru scaderea rapida in greutate si incadrarea in categoria de greutate dorita si ca agent de mascare a steroizilor anabolici androgeni, ceea ce impune efectuarea controlului doping pentru aceste substante [4].

Furosemidul este unul dintre diureticele utilizate cu preponderenta de catre sportivi deoarece determina eliminarea unui volum mare de urina intr-un interval de timp relativ scurt.

Furosemidul este un derivat sulfon-amidic al acidului furfuril-antranilic cu urmatoarea structura chimica prezentata in figura 1 [1].

Urmare a luptei impotriva dopajului in sport, Comisia Medicala a Comitetului International Olimpic a interzis diureticele, incepand cu Jocurile Olimpice din 1998. 

Material si metode

Produsul investigat a fost Furosemidul, medicament produs de Sicomed S.A. Bucuresti.

Administrarea si prelevarea probelor

Medicamentul a fost administrat unui subiect voluntar feminin cu varsta de 40 ani.
O singura doza de Furosemid de 40 mg a fost administrata pe cale orala subiectului.
Probele biologice de urina au fost colectate la 45 minute, 110 minute, 180 minute, 225 minute de la administrarea medicamentului. 

Extractia si purificarea probelor

Extractia principiilor active din probele biologice de urina s-a realizat conform procedurii Screening 5 pentru diuretice adaptata conditiilor noastre de lucru [2].

In figura 2, se prezinta metodologia de extractie solid-lichid pe rasina XAD-2 a furosemidului din probele biologice de urina, precum si metodologia de derivatizare a acestuia. Figura 2. Metodologia de extractie si derivatizare a furosemidului din probele biologice de urina

 Pe coloana de rasina activata – rasina schimbatoare de ioni-polistirenica XAD-2, este trecuta proba biologica de urina; substantele de determinat sunt retinute pe coloana si vor fi apoi eluate cu metanol [2].

Proba se concentreaza prin evaporarea metanolului la sec in atmosfera de azot la 40^ºC.

Derivatizarea probelor 

Extractul biologic este  uscat in vid timp de o ora pe P₂O₅/KOH pentru indepartarea eventualelor urme de apa si crearea conditiilor optime necesare urmatoarei operatii, derivatizarea.

Reziduul obtinut a fost dizolvat in 200ml amestec de derivatizare CH₃I/Acetona (1:10). Derivatizarea s-a realizat prin incalzirea solutiei in prezenta K₂CO₃ la 70ºC timp de 3 ore. Obtinerea derivatului trimetilat este prezentata in figura 3 [3].

Analiza GC/MS

Extractul biologic a fost analizat cu sistemul computerizat Hewlett Packard GC/MS 6890/5972 in modul SIM. Energia de ionizare 70eV. Coloana capilara Ultra 1, 17 m lungime. Gazul purtator Heliu, debit 0,8ml/min. Injectarea s-a realizat cu splitare 1:10. Temperatura injectorului si a interfetei 300ºC.

Programul de temperatura: 200ºC, 15ºC/min., 280ºC, 10ºC/min., 300ºC, 1,2min., 20ºC/min, 310ºC, 2min [3].

Rezultate si discutii 

Identificarea furosemidului s-a realizat prin analiza GC/MS a extractului biologic in modul SCAN, unde la timpul de retentie t_R=4,52 s-au detectat urmatoarele fragmente de masa m/z: 81, 372, 53, 374, 96 [3].

In figura 4 este prezentata cromatograma totala de ioni si spectrul de masa al produsului cercetat. 

Figura 4. Cromatograma totala de ioni si spectrul de masa al furosemidului

Pentru aprecierea excretiei furosemidului, din spectrul de masa s-au selectat fragmentele ionice caracteristice pentru dozarea acestuia prin modul SIM. Aprecierea s-a facut prin compararea ariei fragmentului de masa, m/z=81care este picul de baza avand abundenta relativa de 100% in spectrul de masa. Din analiza datelor prezentate in tabelul 1, se observa ca furosemidul prezinta o eliminare rapida din organism, nivelul maxim excretat renal atingandu-se dupa 18º minute (Fig.5). 

Tabelul 1. Aria picului de baza (m/z=81) si volumul de urina excretat dupa administrarea unei doze unice de 4ºmg furosemid 

Intervalul de timp de la administrarea furosemidului Aria picului de baza (PB)  Volumul de urina excretat 45min. 1.648.619 75ml 85min. 13.704.253 90ml 110min. 14.568.923 90ml 180min. 15.889.658 100ml 225min. 10.725.965 80ml

Figura 5. Nivelul maxim de furosemid excretat renal

Concluzii

- Administrarea de furosemid in doza terapeutica de 40mg pe cale orala, in conditii de hidratare normala, mareste in mod considerabil volumul de urina eliminat

- Marirea diurezei se produce intr-un interval de timp relativ scurt, aproximativ 45min. si se mentine pe o perioada de timp de aproximativ 4 ore; volumul maxim de urina, ca si cantitatea maxima de furosemid excretat, se observa dupa un interval de 2-3 ore. 

Bibliografie

1. Park, Song-Ja, Pyo, Hee-Soo, Mi-Sook, K., Jongsei, P., Systematic Analysis of Diuretic Doping Agents by HPLC Screening and GC/MS Confirmation. Journal of Analytical Toxicology, Vol.14, March/April, 1990.

2. Procedura de extractie pentru diuretice. Screening V, Institut für Biochemie, Deutsche Sporthochschule, Köln.

3. Schanzer, W., The problem of diuretics in doping control. International Athletic Foundation World Symposium on Doping in Sport, Florence, 10-12 May, 1987.

4. Stroescu, V., Bazele farmacologice ale practicii medicale. Vol.1, Bucuresti, Editura Medicala, 1984.