IDENTIFICAREA SI DETERMINAREA CANTITATIVA A SALBUTAMOLULUI IN URINA PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZ/SPECTROMETRIE DE MASA

Ileana Vajiala, Mia Lamor, Graziela Vajiala, Valentin Pop

Institutul National de Cercetare pentru Sport

Introducere

Datorita efectelor terapeutice de bronhodilatare, utilizarea salbutamolului In sport este permisa prin inhalare, ca antiastmatic, cu obligatia notificarii anticipate prezentate In scris de catre medicul sportiv Comisiei Doping. Administrarea pe cale orala sau parenterala este interzisa datorita stimularii SS₂-adrenergice intense si a efectelor anabolice [1].

Ca structura, salbutamolul (fig.1) face parte din grupa simpatomimetice antiastmatice, fiind o amina simpatomimetica derivata de saligenina [2].

Figura 1. Structura chimica a salbutamolului

Salbutamolul este Inrudit cu steroizii anabolici androgeni numai prin efectele sale anabolizante, In timp ce, din punct de vedere farmacologic, se deosebeste ca structura chimica si efect terapeutic de steroizii anabolici androgeni, prezentand structura de SS-fenil-etil-amina, cu un atom de carbon asimetric, diferita de nucleul testosteronului.

Salbutamolul este excretat renal, In cea mai mare parte, In forma nemodificata si ca sulfat [3,4]. In controlul doping, procedura screening pentru determinarea salbutamolului excretat renal se face prin analiza gazcromatografica cuplata cu spectrometria de masa dupa hidroliza enzimatica, masurandu-se, In principal, salbutamolul eliminat liber, datorita hidrolizei limitate a compusului sulfo-conjugat [4,5].

Conform listei substantelor interzise de Comisia Medicala CIO, concentratiile peste care rezultatul testului este considerat pozitiv pentru salbutamol sunt 100 ng/ml proba ca stimulent, respectiv 1000 ng/ml proba ca agent anabolic [1].

Scopul acestei lucrari consta In stabilirea metodei de dozare a abuzului de salbutamol, In conditiile de lucru prestabilite pentru screening-ul substantelor dopante din grupa steroizilor anabolici androgeni, precum si efectuarea unui studiu de excretie renala a salbutamolului, utilizand metoda curbelor de calibrare cu standard intern.

Materiale si metode

Prelucrare probe. Fiecarei probe de urina i s-au masurat densitatea si pH-ul, iar apoi acestea s-au prelucrat dupa metodologia de extractie solid-lichid, purificare, hidroliza si derivatizare a steroizilor anabolici androgeni-fractii combinate, pusa la punct In cadrul Laboratorului de Control Doping din I.N.C.S., descrisa In lucrari stiintifice anterioare [6,7].

Cantitatea de urina luata In lucru a fost de 2ml, la care s-au adaugat 20μl standard intern deuterat, obtinut de la Laboratorul de Control Doping din KOln; hidroliza enzimatica s-a efectuat cu SS-glucuronidaza din E.coli (Roche Diagnostics, Mannheim).

Analiza GC/MS:

Instrument: GC/MSD HP 6890/5972

Coloana: HP Ultra1, lungime 17m, diametru intern 200μm, grosime film 0,11μm;

Gaz purtator: Heliu 0,8ml/min, injectie split 1:10;

Temperatura injector: 300C

Program temperatura:  160C (2min.), 5C/min - 255C, 30C/min - 285C(5min), 60C/min - 300C (2min);

Achizitie MS: - modul SCAN pentru stabilirea timpului de retentie si a spectrului de masa al salbutamolului

• - modul SIM pentru cuantificare salbutamol, ionii monitorizati m/z 86, 369, 440, 455 (salbutamol), 423, 438 (d₄-etiocolanolon), 301, 446 (metiltestosteron);
• - dwell time 40 (4,35 cicluri/sec.).

Curbe de calibrare. Pentru Intocmirea curbelor de calibrare, din standard de salbutamol furnizat de Interchim, Paris (Réf.056327, lot 19/SBM) s-a preparat o solutie de lucru de salbutamol In alcool metilic, avand concentratia de 10μg/ml, din care s-au pipetat volumele corespunzatoare nivelelor de concentratii: pentru curba pe domeniul 50-175ng/ml, cate 10, 15, 20, 25, 30, 35μl, corespunzand nivelelor de calibrare 50, 75, 100, 125, 150, 175ng/ml proba; pentru curba pe domeniul 700-1200ng/ml, cate 140, 160, 180, 200, 220, 240μl, corespunzand nivelelor de calibrare 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200ng/ml proba.

In fiecare esantion din solutia de lucru s-au adaugat 20μl standard intern deuterat, continand 500ng/ml d₄-etiocolanolon. Probele s-au evaporat la sec In atmosfera de azot si s-au derivatizat cu 100μl din amestecul MSTFA/NH₄I/etantiol (1000:2:3).

Studiul de excretie s-a efectuat prin analiza GC/MS a probelor prelevate dupa administrarea orala a unei doze unice de 4mg salbutamol sulfat (Ventolin, Glaxo), la un singur voluntar de sex masculin. Probele biologice s-au prelevat Inaintea administrarii si In interval de 24 de ore dupa administrare.

Calculul concentratiilor. Concentratiile salbutamolului, calculate pe baza curbelor de calibrare cu standard intern, au fost corectate In functie de greutatea specifica.

Rezultate si discutii

Identificarea salbutamolului prin GC/MS. In fig.2 este prezentata cromatograma totala de ioni achizitionata In modul SCAN si spectrul de masa EI al compusului silanizat, salbutamol – tri-O-TMS. In programul de temperatura folosit, parametrii caracteristici pentru identificarea salbutamolului sunt: timpul de retentie 7,01 min si fragmentele de masa caracteristice m/z: 455(M⁺), 86 , 369(100%), si 440, din care 455 este ionul molecular, In timp ce 369 reprezinta picul de baza, cu abundenta de 100%, fata de care se calculeaza abundentele celorlalte fragmente ionice. Timpul relativ de retentie al salbutamolului, calculat fata de SI-metiltestosteron este de 0,402 min.

Figura 2. Cromatograma totala de ioni si spectrul de masa (EI) pentru salbutamol

Dupa stabilirea timpilor de retentie si alegerea fragmentelor de masa caracteristice, s-au efectuat prelucrari In modul SIM (selected ion monitoring), selectand ferestrele de timp In jurul timpilor de retentie ai compusilor studiati.

Dozarea salbutamolului. Curbele de calibrare pentru salbutamol s-au alcatuit prin prelucrarea In modul SIM a solutiilor de concentratii diferite de salbutamol, iar soft-ul sistemului computerizat GC/MS Hewlett Packard 6890/5972, din dotarea Laboratorului de Control Doping, ne-a permis integrarea automata a datelor si trasarea curbelor de calibrare. Din multiplele posibilitati oferite de sistem am selectat calibrarea dupa o curba de regresie liniara si am obtinut curbele corespunzatoare celor doua domenii de concentratii: 50-175ng/ml proba si respectiv 700-1200ng/ml proba, prin intermediul carora s-au calculat concentratiile salbutamolului In fiecare proba. S-au obtinut curbe liniare, avand factorul de corelatie r = 0,996 pentru curba pe domeniul 50-175ng/ml proba si r = 0,968 pentru curba pe domeniul 700-1200ng/ml proba.

In tabelul nr.1 sunt prezentate rezultatele determinarilor cantitative pentru salbutamol, obtinute cu ajutorul curbelor de calibrare mai sus prezentate, pentru subiectul ce a participat la experiment si caruia i s-a administrat o doza unica de 4mg salbutamol.

Tabel nr.1. Dozarile cantitative ale salbutamolului pentru subiectul participant la experiment.

Nr.crt. Momentul recoltarii pH Densitate Factor de corectie Salbutamol(ng/ml proba) 1. Inaintea adm. 5,0 1,030 0,688 0 2. 6,1 ore dupa adm. 6,0 1,010 1,833 28,42 3. 10,3 ore dupa adm. 7,0 1,015 1,294 3,49 4. 11,3 ore dupa adm. 6,0 1,020 1,000 1,70 5. 23,0 ore dupa adm. 6,0 1,020 1,000 2,90

Curba de eliminare renala. In fig.3 este prezentata curba excretiei renale a salbutamolului, Intocmita pe baza datelor experimentale, care constau In estimarea concentratiilor salbutamolului din curba de calibrare.

Profilul excretiei renale a salbutamolului prezinta un maxim la 6,1 ore de la Incetarea administrarii (28,42ng/ml), dupa care excretia acestui produs medicamentos se face lent, pana la 24 de ore. Consideram ca este necesara o cercetare ulterioara, prin utilizarea de doze si cai diferite de administrare a salbutamolului si pe un numar mai mare de subiecti, In scopul diferentierii Intre salbutamolul aplicat oral, care este prohibit, si cel aplicat prin inhalatii, In doze terapeutice, pentru sportivii astmatici.

Figura 3. Curba excretiei renale a salbutamolului dupa administrarea orala a unei doze de 4mg.

Concluzii

Salbutamolul poate fi identificat prin metoda screening GC/MS pe baza parametrilor caracteristici: T_R=7,01 min si fragmente ionice m/z: 369; 86; 440 si 455.

Utilizarea sistemului computerizat GC/MS Hewlett Packard 6980/5972 ne-a permis stabilirea unei metodologii de cuantificare a salbutamolului pentru cele doua domenii de concentratii (50-175ng/ml proba si 700-1200ng/ml proba), care includ valorile pentru care salbutamolul este interzis ca stimulent (100ng/ml) sau ca anabolizant (1000ng/ml).

Concentratia salbutamolului, estimata printr-o procedura screening conventionala, poate fi folosita ca o masurare preliminara pentru selectia cazurilor suspecte de administrare orala a salbutamolului In controlul doping.

Bibliografie

1. Bellahn, I., Nolteernsting, E., Opfermann, G.; Schanzer,W., Preliminary results of excretion studies with Salbutamol. In: Recent Advances in Doping Analysis (vol.6). KOln, Ed. Sport & Buch StrauSS, pag. 489-496.

2. Bergés, R., Segura, J., Fitch, K.D., Morton, A.R., de la Torre, X., Ventura, R., Mas, M., Farre, M., Discrimination of prohibited oral use of Salbutamol in sport from authorized inhaled asthma treatment: update. In: Recent Advances in Doping Analysis (vol.7). KOln, Ed. Sport & Buch StrauSS, pag193-202.

3. Bergés, R., Segura, J., Ventura, R., de la Torre, X., Mas, M., Farré, M., Fitch, K.D., Morton, A.R., Ueki, M., Oral versus Inhaled Salbutamol: Is Distinction Possible by Urine Analysis? In: Recent Advances in Doping Analysis (vol.6). KOln, Ed. Sport & Buch StrauSS, pag. 405-419.

4. Ordinul Ministerului Tineretului si Sportului nr. 329 din 07.2001, privind masurile de prevenire, control si reprimare a folosirii substantelor interzise.

5. Stroescu, V., Bazele farmacologice ale practicii medicale. Bucuresti, Ed.Medicala, 1984, vol.1, pag. 359-367.

6. Vajiala, G., Lamor, M., Sistem computerizat GC/MS Hewlett Packard utilizat In diagnoza doping a sportivilor de performanta, a II-a Conferinta de Inginerie Biomedicala cu participare internationala, "INGIOMED 2001", Bucuresti, 13-14 dec. 2001.

7. Vajiala, G., Lamor, M., Subasu, R., Influence of benzbromarone on steroid profile parameters and renal excretion of anabolic steroids, Romanian Biotechnology Letters, vol. 6, nr. 4, 2001, p.333-341.