PROGRAM PENTRU DETECTAREA PRIN TEHNICA GC/MS A UNOR SUBSTANTE INTERZISE IN SPORT, DIN CATEGORIA STIMULENTELOR

Barbu Chitimia, Graziela Vajiala,

Luminita Lamor, Georgeta Bican

Institutul National de Cercetare pentru Sport

Introducere

Programul permite decelarea urmatoarelor substante: amfetamina, metilamfetamina, fentermina, efedrina, metilefedrina, fenfluoramina, metoxifenamina, pentetrazol, fenproperex, prolintan, clobenzorex, cafeina, fencamfamina, bromantan, care sunt analizate ca atare sau sub forma metabolitilor acestora excretati de organism in urina.

Utilizarea tehnicii gc/ms este in acest caz consecutiva unei operatii prealabile de „screening", efectuata folosind tehnica gaz cromatografica (gc), cu detector specific pentru compusi care contin azot si fosfor (asa numitul detector npd, folosit pentru ca majoritatea acestor compusi contin azot in molecula). Desi acest detector este suficient de sensibil (limita de detectie, pentru anumite substante, este de ordinul zecilor de picograme), identificarea substantelor de interes tinand cont doar de timpii de retentie, furnizati de tehnica gc cu detectori clasici (npd, fid, Hall, flam fotometric, cu fotoionizare etc.), este considerata insuficienta, avand in vedere faptul ca, in domeniul sportului, substantele mentionate sunt considerate substante dopante, care, decelate in organismul sportivului, pot determina sanctionarea acestuia cu pedepse foarte aspre, mergand pina la suspendarea din activitatea competitionala. De aceea, pentru evitarea raportarii de rezultate fals pozitive, probele declarate suspecte in urma analizei gc/npd sunt reanalizate folosind tehnica gc/ms. Aceasta beneficiaza de avantajul de a putea caracteriza substanta de interes, separata prin gc, prin intermediul spectrului de masa generat de detectorul specific atasat sistemului de analiza, care in acest caz este un detector cuadrupolar.

Materiale si metoda

Sistemul de analiza este un aparat gc/ms produs de firma Agilent, model 6890/5972.

Conditii cromatografice:

• coloana capilara Agilent HP-5, 5% methyl phenyl siloxane, 25m, diametrul 0.25 mm, grosimea filmului activ 0.25 um;
• Mod constant flow, 0.8 ml/min, gaz purtator He, presiune initiala in coloana 5.9 psi;
• Program de temperatura: 100^oC-145^oC-165^oC-300^oC; paliere de temperatura la temperaturile intermediare si finala de 2 min; rampa de temperatura de 20^o C/min.
• Temperature injectorului 300^oC; volum de injectie 1ul, modul split 1:10

Limbajul de programare este cel furnizat de firma producatoare. Acesta are aparenta unui sistem de comenzi Basic, puternic specializat pe comenzi specifice tipului de analiza efectuat (de pilda, comenzile de integrare a peak-urilor cromatografice beneficiaza de doua mecanisme de integrare, exista cateva tipuri de netezire a semnalului - netrezirea gaussiana, Savitzky-Golay sau definita de utilizator etc.-), dar care are la baza un limbaj C++, orientat pe obiecte.  

Sistemul de achizitie a datelor furnizate de detectorul cuadrupolar poate fi programat sa lucreze in doua moduri: modul scan, care ofera spectrul de masa complet al componentelor cromatografice sau modul sim („selected ion monitoring"). Acest din urma mod permite urmarirea prezentei in efluentul cromatografic a anumitor ioni, considerati specifici pentru o anumita substanta. Micsorarea numarului de ioni analizati ofera insa avantajul obtinerii unei sensibilitati marite, din acest motiv acesta este modul de achizitie a datelor utilizat in analiza substantelor mentionate.

In cadrul Laboratorului de Control Doping ( LCD) al Institutului National de Cercetari pentru probleme de Sport au mai fost elaborate programe de analiza calitativa si/sau cantitativa pentru anumite clase de substante interzise in sport, cum ar fi clasa steroizilor anabolici, clasa substantelor cu proprietati diuretice etc [1,2,3]. In comparatie cu acestea, programul de fata prezinta urmatoarele imbunatatiri:

Nu este necesara definirea, pentru fiecare compus in parte, a ferestrei de timp unde se presupune ca ar trebui sa apara peak-ul cromatografic caracteristic unui anume compus. Programul poate decela, in fereastra de timp specificata de operatorul care a derulat software-ul de achizitie a datelor cromatografice, acele peak-uri cromatografice care au, simultan, acelasi timp de retentie pentru toti ionii considerati caracteristici pentru compusul respectiv. Operatia de identificare a peak-urilor cu aceasta proprietate este asistata de informatia dobandita din examinarea ion-cromatogramelor unui amestec standard format din toate substantele mentionate.

In general, ionii care caracterizeaza o substanta analizata prin tehnica spectrometriei de masa, se clasifica in: ionul de baza (de obicei, ionul cu abundenta cea mai mare) si ioni care "certifica" ("qualifiers") ionul de baza. Programul calculeaza abundentele relative ale ionilor caracteristici unei anumite substrante si compara valorile obtinute cu cele calculate pentru amestecul de standarde. Programul poate atribui, la nevoie, o "cifra de merit"( "quality of the hit") a procesului de identificare, care reflecta siguranta cu care se poate afirma ca identificarea a fost corecta. In modul normal de lucru ("default"), neidentificarea ionului de baza este considerata o dovada suficienta pentru respingerea ipotezei prezentei substantei de interes in efluentul cromatografic. Cifra de merit este in acest caz zero.

Programul poate executa analiza consecutiva a mai multor seturi de date, de exemplu analiza probelor apartinand unei secvente. 

Programul scoate la imprimanta, sub forma grafica, ferestrele de timp centrate pe timpul de retentie al peak-urilor cromatografice din amestecul de referinta. Sunt imprimate si abundentele relative ale ionilor caracteristici, atat cele corespunzatoare amestecului standard, cat si cele apartinand probei analizate. In figurile 1 si 2 sunt prezentale doua exemple de felul cum raporteaza programul rezultatele. Este prezentat raportul in care un amestec standard mai vechi este analizat in comparatie cu unul nou. In figura 2 proba analizata este o proba necunoscuta, cu rezultate negative.   

Se poate observa ca valorile abundentelor relative ale probei necunoscute (fig.1), care sunt prezentate in prima linie, sunt pastrate multumitor, diferentele cele mai mari inregistrandu-se in cazul ionilor cu abundentele cele mai mici. Acesta este motivul pentru care ponderea atribuita acestor ioni (care pot fi considerati ca "nesiguri") in stabilirea cifrei de merit de care am amintit anterior este cea mai mica. Pe de alta parte, din figura 2 se poate observa ca programul raporteaza inexistenta in proba a celor 4 compusi chimici mentionati (pe prima rubrica rezervata abundentelor relative este trecuta cifra 00), chiar daca, in cazul efedrinei, se constata prezenta unor peak-uri cu timpul de retentie caracteristic conditiilor cromatografice enuntate anterior pentru aceasta substanta. Explicatia este urmatoarea: programul raporteaza concentratie zero pentru acest produs pentru ca abundentele relative sunt diferite fata de standard si, in plus, pentru ca valorile concentratiei produsului sunt oricum mult sub limita de concentratie care incrimineaza sportivul, limita stabilita de comisia de specialitate din cadrul CIO [4] .

Fig. 1. Rezultatele analizei unei probe, care este in acest caz este un amestec standard mai vechi analizat in raport cu un amestec preparat chiar in momentul executarii analizei.

Fig. 2 Rezultatele analizei unei probe reale, analizate fata de standardul folosit in fig.1

In concluzie, se poate afirma ca programul elaborat ofera un mare grad de automatizare efectuarii analizei. Practic, operatorul trebuie sa indice doar fisierele care contin standardele si probele de analizat, in varianta "sequence analysis" nefiind nevoie nici de acest lucru, raportul fiind generat automat la sfarsitul secventei.

BIBLIOGRAFIE

Chitimia, B., Vajiala, E., Lamor, M., " Metoda computationala de analiza cantitativa a hormonilor androgeni, cu aplicatii in problemele de control doping", in vol. Sport Curat, Conferinta Stiintifica Internationala, Bucuresti, 26-28 oct. 2001, pp.72-77

Chitimia, B., Vajiala, E., Lamor, M., " Metode de calibrare folosite in determinarile de substante dopante ",  in vol. Interdisciplinaritate, Conferinta Stiintifica Nationala, Bucuresti, 31 oct.-1 nov. 2002, pp.73-79

Vajiala, E., Lamor, M., Vijiala, I., Pop, V., Chitimia, B., "Confirmarea nandrolonului in controlul doping prin tehnica cromatografiei de gaz cuplata cu spectrometria de masa in vol. Interdisciplinaritate, Conferinta Stiintifica Nationala, Bucuresti, 31 oct.-1 nov. 2002, pp.342-347

 Vajiala, E., Lamor, M., Doping-Antidoping, Bucuresti, ed. Fest, 2002, p. 36

Cuvinte cheie: doping; software; stimulente. 

Abstract:

A data analysis programme, using the tehnique of gas chromatography/mass spectrometry for some compounds prohibited in sport, belonging to the class of stimulants, is presented. Among the analysed compounds (14) are: amphetamine, methilamphetamine, efedrine, metilephedrine, pentetrazole, clobenzorex, prolintane, bromantane, metoxiphenamine. The programme is written in the specific language provided by Agilent Technologies for its range of Chemstations software products. The software is the latest version of a series of programmes dedicated to the analysis of clases of compounds.