 |
 |
 |
 |
SCREENINGUL SI CONFIRMAREA SUBSTANTELOR DIN CLASA STIMULENTELOR
Georgeta Bican , Graziela Vajiala,
Mia Lamor , Carla Done
Institutul National de Cercetare pentru Sport
Key words: stimulents, ; screening; confirmation, GC/NPD, GC/MS.
Cuvinte cheie: stimulente; screening; confirmare, GC/NPD, GC/MS.
Rezumat
Sectiunea 1 a Standardului International – Lista substantelor interzise pe 2004 cuprinde substantele din categoria stimulentelor interzise in sportul de performanta.
Lucrarea prezinta metodologia de identificare a substantelor volatile cu azot prin cromatografie de gaz cu detector specific de azot si fosfor, GC-NPD si de confirmare a acestora prin cromatografie de gaz cuplata cu spectrometrie de masa, GC/MS.
Prelucrarea probelor se bazeaza pe procedeul de extractie licid-lichid a principiilor active cu un solvent organic la pH bazic. Separarea cromatografica se realizeaza in gradient de temperatura in domeniul 100-3000C.
Identificarea substantelor de determinat are loc prin stabilirea parametrilor cromatografici caracteristici: timpul de retentie, tR si timpul de retentie relativ, tRR. Confirmarea unei substante are loc prin compararea cu standardul a timpului de retentie si a spectrului de masa caracteristic, a abundentei relative a ionilor caracteristici.
Metoda permite screeningul si confirmarea a peste 25 stimulente.
Introducere
Pe Lista substantelor interzise din 2004, la sectiunea S1 a Standardului International sunt incluse substante din categoria stimulentelor ce sunt interzise in sportul de performanta [1].
Utilizarea stimulentelor, ca substante ce imbunatatesc considerabil activitatea psihica si fizica este cunoscuta din vechi timpuri. Folosirea repetata a acestor substante are efecte negative asupra organismului uman: deteriorarea functiilor psihice, cresterea presiunii sangelui si a temperaturii corporale, cresterea riscului de boli cardiovasculare etc.
De mare interes este amfetamina (ale carei cai de sinteza si efecte au fost studiate cu circa saptezeci de ani in urma), o substanta foarte utilizata ca atare dar si produs de metabolizare pentru multe substante din clasa stimulentelor [2].
Identificarea substantelor din clasa stimulentelor in probele de control doping are la baza principiul tehnicii cromatografiei de gaze cu detector specific azot - fosfor. O data evidentiate aceste substante dopate, este necesara confirmarea lor, ceea ce se realizeaza prin tehnica cromatografiei de gaze cuplata cu spectrometria de masa.
Materiale si metode
Pentru punerea la punct a metodei s-au folosit solutii etalon de 1mg/ml de amfetamina, bromantan, bupropion, cafeina, clobenzorex, crotetamida, efedrina, fencamfamin, fendimetrazin, fenmetrazin, fenetilina, fenproporex, fentermina, heptaminol, mefentermina, metadona, metamfetamina, 3,4metilendioxiamfetamina (3,4-MDA), metoxifenamina, metilefedrina, metilfenidat, N-etilamfetamina, N,N-dimetilamfetamina, norefedrina, pentazocina, pentetrazol, petidina, prolintan. Din aceste solutii s-a preparat un amestec de calibrare de concentratie 50ppm. Aceste standarde au fost procurate de la Sigma – Aldrich si NARL.
Pentru amfepramona, s-a utilizat o urina de referinta. Ca standard intern s-a folosit o solutie de diisopropilaminododecan, DIPA 12 de concentratie 100ppm.
Prelucrarea probelor
Probele biologice de urina au fost preparate in vederea extractiei stimulentelor volatile conform procedurii Screening 1 [3].
Extractia stimulentelor volatile se realizeaza prin procedeul de extractie lichid-lichid intr-o singura etapa cu un solvent organic in mediu alcalin [4,5]. Extractia lichid-lichid este o metoda de separare si concentrare care consta in transferul selectiv al unor substante dintr-o faza lichida in alta faza lichida. Frecvent, una dintre faze este apoasa iar cealalta un solvent organic. Principiul extractiei lichid-lichid se bazeaza pe faptul ca substantele de separat au o afinitate mica pentru faza apoasa si respectiv o afinitate mare pentru faza organica.
In conditii de agitare mecanica, la pH 9,6 principiile active trec in stratul eteric. Separarea fazelor, faza organica de faza apoasa se realizeaza prin centrifugare. Supernatantul este transvazat cu ajutorul unei pipete Pasteur intr-un tub conic. Concentrarea extractelor biologice se realizeaza prin evaporarea solventului organic la block-heater in mediu anaerob. Reziduul este reluat cu 100l alcool metilic distilat si transferat in vialuri cu insertie pentru GC/NPD, respectiv GC/MS.
Parametrii analitici
Analizele au fost efectuate pe echipamentele mentionate in Tab.1 utilizand urmatorii parametri analitici:
Tabel 1. Parametrii analitici ai analizei screening si de confirmare a stimulentelor volatile.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
Rezultate si discutii
Metoda prezentata permite detectia compusilor volatili cu azot. Aceste substante sunt excretate liber in urina la concentratii mari ceea ce permite o extractie directa a acestora cu un solvent organic in mediu alcalin fara a fi necesara hidroliza si derivatizarea lor.
In analiza screening, pentru fiecare substanta de analizat se stabilesc parametrii cromatografici caracteristici, timpul de retentie, (tR) si timpul de retentie relativ, (tRR) prin compararea acestora cu un standard intern.
Tabel 2. Parametrii cromatografici caracteristici ai analizei screening GC/NPD a stimulentelor volatile.
|
In tabelul 2 sunt prezentate substantele detectate, impreuna cu timpii de retentie (tR) si timpii de retentie relativi (tRR) in ordinea de elutie cromatografica. Ca standard intern s-a utilizat diizopropilaminododecanul, DIPA 12 functie de care s-au calculat timpii de retentie relativi (tRR) ca fiind raportul intre timpii de retentie ai substantelor detectate (tR) si timpul de retentie al standardului intern.
 |
Cromatograma pentru un amestec etalon obtinuta prin analiza screening GC/NPD este prezentata in figura 1.
Analiza GC/NPD indica doar posibilitatea prezentei substantei in proba biologica de urina, confirmarea acesteia se realizeaza prin GC/MS. Pentru fiecare substanta de determinat s-a stabilit timpul de retentie, timpul de retentie relativ precum si spectrul de masa caracteristic. Interpretarea rezultatelor se realizeaza prin compararea parametrilor cromatografici caracteristici ai compusilor din proba de analizat cu parametrii caracteristici ai standardelor respective (tabelul 3) [6].
Se observa din tablelul 3 ca fentermina si metamfetamina au spectrul de masa identic dar timpi de retentie diferiti. De asemenea, etilamfetamina, N,N-dimetilamfetamina precum si mefentermina desi au spectre de masa asemanatoare prin parametrii analitici stabiliti s-a reusit o buna separare a acestor compusi asa cum se poate observa din tabelul 3.
Prin metoda screening care utilizeaza gaz-cromatografia cu detector specific azot-fosfor bupropionul si fenproporexul coelueaza; de asemenea, nu s-a reusit o buna separare pentru fencamfamina si crotetamida dupa cum se observa din tabelul 2 si figura 1. Utilizarea cromatografiei de gaz cuplata cu spectrometria de masa, a parametrilor analitici stabiliti a dus la o buna separare a picurilor cromatografice a compusilor de determinat.
Tabel 3. Parametrii cromatografici caracteristici ai analizei de confirmare GC/MS a stimulentelor volatile.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 |
Concluzii
Metoda permite detectia si confirmarea unui numar mare de stimulente volatile intr-un timp de analiza relativ scurt de 18 minute.
Parametrii analitici utilizati permit identificarea cu precizie a compusilor greu de separat: bupropionul si fenproporexul, fencamfamina si crotetamida, fentermina si metamfetamina precum si a etilamfetaminei, N,N-dimetilamfetaminei si mefenterminei.
Abstract
The section S1 of the Prohibited List – International Standard contains the substances from category of prohibited stimulants in sport performance.
The paper describes the methodology of identification of volatile stimulants by gas chromatography with specific nitrogen and phosphor detector, GC/NPD, and the methodology of confirmation of these substances by gas chromatography coupled with mass spectrometry, GC/MS.
The urine sample preparation is based on the liquid – liquid extraction of the compounds of interest, with an organic solvent, at alkaline pH. The chromatographic separation is achieved in temperature gradient within 100 - 300ºC.
The identification of the substances to be determined has been realized by the measurement of the specific chromatographic parameters: the retention time, RT, and the relative retention time, RRT. The confirmation of the substances had been realized by comparing the retention time and the specific mass spectrum, the relative abundance of the specific ions, to those of the pure standard of each substance.
The method permits the screening and the confirmation of more than 25 stimulants.
Bibliografie
2004 WADA Prohibited List – International standard.
Toxicological Analysis, ed. by R. Klaus Müller, edition MOLINA press Leipzig, 1995.
Subasu R., Vajiala, Lamor M., Bican M., Analiza suplimentelor nutritionale pentru evidentierea contaminarii cu efedrina si cafein. Conferinta Stiintifica Internationala „Sport Curat", Bucuresti, 26-28 octombrie 2001, p.389-394.
Hemmersbach, P.; de la Torre, R. Stimulants, narcotics and β-blockers: 25 years of development in analytical techniques for doping control. In: Journal of Chromatography B, vol. 687 (1996), p.221-238.
Lho, Dong-Seok; Hong, Jong-Ki; Paek, Heang-Kee; Lee, Jeong-Ae; Park, Jongsei, Determination of Phenolalkylamines, Narcotic Analgesics, and Beta-blockers by GC-MS. In Journal of Analytical Toxicology, vol. 14, March/April 1990, p.77-83.
Parr, M.K; Geyer,H.; Sigmund, G.; Kohler,K.; Schänzer, W., Screening of Nutritional Supplements for Stimulants and other Drugs. Proceedings of the 21th Cologne "Manfred Donike" Workshop on Dope Analysis, March 2003.
