 |
 |
 |
 |
SCREENING-UL DIURETICELOR PRIN TEHNICA LC/MS/MS
Valentin Pop, Georgeta Bican,
Graziela Vajiala, Mia Lamor
Institutul National de Cercetare pentru Sport
Key words: diuretical substances; LC/MS; screening; confirmation
Cuvinte cheie: diuretice; LC/MS; screening; confirmare
Rezumat
Abuzul de substante cu actiune diuretica in sport precum si cresterea numarului de medicamente de pe piata, a impus realizarea de metode analitice de mare sensibilitate. Prin dotarea Laboratorului de Control Doping cu un echipament de ultima generatie LC/MS/MS Varian 1200L a fost elaborata o noua tehnica analitica, ideala pentru detectia diureticelor. Aceasta metoda ofera specificitate, poate rezolva dificultatile existente in analiza unor matrici complexe, precum urina, si sensibilitate metodei prin operare in modul MRM.
Introducere
Compusii din clasa diureticelor se afla pe lista substantelor interzise [1], la sectiunea S8-agenti mascatori. Substantele cu actiune diuretica sunt de obicei compusi din clasa sulfamidelor dar pot proveni si din clasa compusilor heterociclici aromatici, acizilor ariloxiacetici sau chiar steroidici (fig.1). Metoda utilizata pana in prezent in controalele doping de rutina a avut la baza principiul tehnicii cromatografiei de gaze cuplata cu spectrometria de masa, GC/MS [2,3,]. Prelucrarea extractelor biologice in vederea analizei GC/MS presupune ca etapa premergatoare analizei derivatizarea cu iodura de metil in acetonitril, etapa ce mareste semnificativ timpul de preparare a probelor.
Dupa dotarea Laboratorului de Control Doping cu un cromatograf de lichide de inalta presiune cuplat cu un spectrometru de masa in tandem, cu triplu quadrupol, LC/MS/MS Varian 1200L, am avut acces la o noua tehnica analitica, de inalta sensibilitate si selectivitate, ideala pentru analiza diureticelor [5,6].
 |
Materiale si metode
Metoda a fost dezvoltata pe solutii etalon de acetazolamid, acid etacrinic, altiazid, amilorid, bendroflumetiazid, bumetanid, canrenon, clopamid, clorotiazid, clortalidon, hidroclorotiazid, indapamid, furosemid, probenecid, triamteren in concentratie de 10ppm. Standardele au fost procurate de la Sigma-Aldrich.
Prelucrare probe. Metoda de extractie este similara metodei de extractie utilizate in tehnica GC/MS folosita anterior [2,4], cu deosebirea ca dupa evaporarea fazei organice reziduul obtinut nu se mai usuca in vederea derivatizarii, ci este reluat cu 100μL amestec metanol:apa 1:1.
Parametrii analitici. Analiza a fost efectuata pe echipamentul sus-mentionat, folosind o coloana OmniSpher 3 C18 (100 x 2.0mm diam.int., dimens.part. 3m).
Conditii LC: faza mobila, A=metanol / B=5Mm acetat de amoniu si 0,1% acid acetic in apa ultrapura Millipore; debit 0,25mL/min, gradient A: 15% timp de 2min, 15%55% in 10min, 55%65% in 8min si 10min reechilibrare 15%, volum injectie 10L.
Conditii MS: APCI 500C, mod de ionizare negativ sau pozitiv si monitorizarea reactiilor multiple (MRM), timp de scanare 1s, presiune Ar in celula de coliziune 1,50mTorr.
Rezultate si discutii
Analiza screening
Functie de structura moleculei substantei se selecteaza modul de ionizare in cursul analizei, negativ sau pozitiv, corespunzator afinitatii pentru protoni a compusului respectiv:
In tabelul 1 sunt prezentate substantele analizate, timpii de retentie corespunzatori, monitorizarea reactiilor multiple (MRM) ale ionului quasi-molecular (M-H)- sau (M+H)+ in cate un ion secundar specific dupa disocierea in celula de coliziune, tranzitiile specifice la energiile de coliziune stabilite.
Au fost retinute in screening cate 2 tranzitii de fiecare diuretic. In figura 2 este prezentata cromatograma LC/MS/MS a unui amestec de standarde.
Tabel 1. Parametrii analitici ai diureticelor in analiza screening prin LC/MS/MS.
|
Confirmarea diureticelor
Pentru confirmarea prezentei diureticelor in probele suspecte, a fost necesara dezvoltarea metodei prin monitorizarea a minim 3 tranzitii specifice pentru fiecare diuretic.
Astfel, pentru furosemid, dupa studierea spectrului de masa al ionului quasi-molecular in urma disocierii din celula de coliziune, tranzitiile selectate au fost:
(-) 329 > 285, + 20,0; (-) 329 > 284, + 20,5; (-) 329 > 205, + 30,5; (-) 329 > 126, + 40,0 si (-) 329 > 78, + 32,0.
In figura 3 sunt prezentate comparativ, cromatograma standardului de furosemid si cromatograma unei probe de urina continand furosemid.
Concluzii
Abstract
The misuse of diuretic agents in sport and the increasing amount of these compounds on the market require highly sensitive and reliable analytical methods. Since the Doping Control Laboratory has been equipped with the new LC/MS/MS Varian 1200L a new analytical technique, ideal for diuretics detection, was developed. The method can offer the specificity and robustness to meet the challenge of analysis in complex and difficult matrices, such as urine, and the sensitivity has been proved in the MRM mode
Bibliografie
2004 WADA Prohibited List – International standard.
LISI, A.M.; KAZLAUKAS, R.; TROUT, G.J., (1992) J. Chromatogr. B, Biomed. Appl., 581, 57-63.
AMENDOLA, L.; COLAMONICI, C.; MAZZARINO, M.; BOTRÉ, F., (2003) Anal. Chim. Acta, 475:125-136.
BICAN, G.; SUBASU, R.; LAMOR, M, Detectia Furosemidului in urina umana prin cromatografie de gaze cuplata cu spectrometrie de masa, Conferinta Stiintifica Nationala "Interdisciplinaritatea" – Bucuresti, 31 octombrie 2002", 40-44.
THIEME, D.; GROSSE, J.; LANG, R.; MÜLLER, R.K.; WAHL, A., (2001) J. Chromatogr. B, 757, 49-57.
DEVENTER, K.; DELBEKE, F.T.; ROELS,K.; Van EENOO, P., (2002) Biomed. Chromatogr., 16, 529-535.
