METODA DE CONFIRMARE A ABUZULUI DE CLENBUTEROL PRIN SPECTROMETRIE DE MASA DE INALTA REZOLUTIE (HRMS)

Ileana VAJIALA, Mia LAMOR, Graziela VAJIALA

Institutul National de Cercetare pentru Sport

Keywords: high resolution mass spectrometry (HRMS); confirmation; clenbuterol

Cuvinte cheie: spectrometrie de masa de inalta rezolutie (HRMS); confirmare; clenbuterol

Rezumat

Pentru a confirma prin HRMS rezultatele unei analize screening, probele de urina se reanalizeaza dupa purificare prin proceduri specifice care sa izoleze selectiv substanta de interes si metabolitii acesteia. Necesitatea unor tehnici de purificare adecvate care sa ofere dovezi fara echivoc ale abuzului de steroizi anabolici rezulta din urmatoarele motive:

• concentratia in urina a substantelor in cauza este foarte scazuta, uneori aproape de limita de detectie a instrumentelor,
• probele biologice de urina reprezinta matrici complexe iar interferentele background-ului biologic afecteaza puternic detectia prin GC/MS-Q.

Pentru confirmarea abuzului de Clenbuterol, reextractia probei si prelucrarea fazei apoase clorhidrice reduce mult background-ul biologic, iar aplicarea spectrometriei de masa de inalta rezolutie imbunatateste spectaculos limita de detectie.

Introducere

Daca in urma unei analize screening, efectuata atat prin cromatografie de gaze cuplata cu spectrometrie de masa cu filtru quadrupol (GC/MS-Q) cat si prin spectrometrie de masa de inalta rezolutie (GC/HRMS), o proba supusa controlului doping este suspecta pe o substanta interzisa, este necesara o testare suplimentara de confirmare, care sa demonstreze fara ambiguitati prezenta acesteia. Daca a trecut o perioada relativ lunga de la sistarea administrarii agentului anabolic in scop de dopaj, se reduc sansele de a detecta in urina sportivului substanta in cauza pentru ca metabolitii acesteia se vor elimina in cantitati foarte mici. Pentru a depasi aceasta dilema, procedura analitica de confirmare trebuie sa prezinte sensibilitate si specificitate crescuta iar proba considerata pozitiva trebuie reextrasa printr-o procedura care sa izoleze numai substanta in cauza. Tehnica analitica capabila sa raspunda acestor cerinte este GC/HRMS [1].

Pornind de la considerentele de mai sus si dupa instalarea, in iunie 2003, a echipamentului de inalta rezolutie compus din cromatograf de gaze Agilent Technologies GC 6890N cuplat cu spectrometru de masa cu dublu sector MAT 95XP ThermoFinnigan, Laboratorul de Control Doping a dezvoltat metode de confirmare prin rezolutie inalta (HRMS) pentru metabolitii de excretie pe termen lung ai Stanozololului si Clenbuterolului.

Clenbuterolul este un ß₂-agonist si un stimulent al sistemului nervos central dar este folosit si ca agent anabolic. Se administreaza in doze foarte mici astfel incat concentratia lui in urina este scazuta. Reextractia probei si prelucrarea fazei apoase clorhidrice reduce mult background-ul biologic [2]. Daca substantele care interfera au compozitii chimice considerabil diferite de compusii de interes, in special pentru cele continand heteroatomi, cum este si cazul Clenbuterolului care contine clor, aplicarea spectrometriei de masa de inalta rezolutie imbunatateste spectaculos limita de detectie [3].

Materiale si metode

Metoda a fost dezvoltata pe o proba de urina negativa la care s-a adaugat solutie 1ppm de substanta de referinta pentru Clenbuterol astfel incat concentratia sa fie de 2 ng/mL proba, si solutie 1ppm standard intern Clenpenterol in concentratie de 10ng/mL proba. Ambele substante de referinta sunt preparate la Laboratorul Doping din Köln. Aceasta proba va fi considerata suspecta pe Clenbuterol.

Prelucrare probe: Reextractia probei in vederea confirmarii Clenbuterolului urmareste reducerea background-ului biologic [4,5]. Dupa ajustarea pH-ului probei la valoarea 12 si extractie cu tertiar-butilmetil eter, se adauga acid clorhidric diluat si se indeparteaza stratul eteric. Faza clorhidrica se usuca si se derivatizeaza pentru analiza GC/HRMS. Schema completa de prelucrare a probelor de urina pentru confirmarea abuzului de Clenbuterol este prezentata in figura 1. In paralel cu proba de confirmat se lucreaza un blank de apa, un blank de urina si o urina negativa la care s-a adaugat solutie 1ppm standard de Clenbuterol, in concentratie de 4ng/mL proba. In toate probele se adauga standard intern de Clenpenterol in concentratie de 10ng/mL proba.

Parametrii analitici: Analiza a fost efectuata pe echipamentul sus-mentionat.

Parametrii metodei GC:

• Coloana: Agilent HP-1, 17m lungime, 0,2mm diametru intern, film 0,11m;
• Gaz purtator: Heliu, 0,7mL/min;
• Injector: Temperatura 300⁰C, injectie fara splitare;
• Program de temperatura: 100⁰C (0min), 15⁰C/min. pana la 210⁰C (0min), 30⁰C/min. pana la 300⁰C (1min);

Conditii MS:

• Sursa de ionizare: impact electronic la 70eV, 1mA curent de emisie, temperatura 230⁰C;
• Tensiunea multiplicatorului de electroni: 2,0kV;
• Rezolutia: 5000;
• Mod de operare: detectia mai multor ioni (MID).

Rezultate si discutii

Criteriile de identificare in determinarile calitative prin cromatografie si spectrometrie de masa sunt stabilite de Documentul tehnic TD2003IDCR din Standardul International pentru Laboratoare elaborat de Agentia Mondiala Antidoping AMA [6]. Astfel, pentru ca o substanta interzisa sa fie declarata prezenta intr-o proba suspecta, timpul de retentie in coloana cromatografica nu trebuie sa difere cu mai mult de 1% fata de o proba continand substanta de referinta, iar la detectia prin spectrometria de masa, modul de achizitie SIM, 3 ioni specifici sa prezinte un raport caracteristic al abundentelor si sa se incadreze in intervalele de toleranta stabilite pentru intensitatile lor relative.

S-a dezvoltat o metoda MID specifica Clenbuterolului care contine 1 fereastra de timp (7.00-9.00 min.) si care monitorizeaza 7 fragmente de masa caracteristice izotopilor de clor (300,1006; 334,0617; 335,0695; 336,0587; 337,0666; 338,0558; 339,0636), fragmente care au furnizat zgomot de fond redus si intensitate ridicata. Dupa reextractia probei conform schemei prezentate in fig.1 si analiza HRMS s-a obtinut cromatograma prezentata in fig.2 in care Clenbuterolul elueaza la timpul de retentie 7,43 min., iar standardul intern de Clenpenterol la timpul de retentie 7,95 min. Se verifica prezenta Clenbuterolului in proba suspecta si pe baza cerintelor Standardului International pentru Laboratoare al AMA [6] pentru cel putin 3 fragmente de masa (Tabel 1), la care abundenta relativa se incadreaza in intervalul de acceptare.

Tabel 1. Confirmarea Clenbuterolului conform documentului tehnic TD2003IDCR din Standardul International pentru Laboratoare elaborat de Agentia Mondiala Antidoping AMA

Standard Clenbuterol (4 ng/ml) Timp ret = 7,42(min) Proba suspecta m/z Inaltimea picului Abundenta relativa (%) Interval de acceptare Abundenta relativa (%) Inaltimea picului Timp retentie (min) 335 95007 100,00   100,00 111253 7,43 300 55083 57,98 47,98-67,98 53,18 59160   334 62780 66,08 56,08-76,08 67,24 74810   336 66164 69,64 59,64-79,64 62,85 69926   337 70188 73,88 63,88-83,88 64,91 72210   338 21591 22,73 17,73-27,73 20,14 22403   339 13669 14,39 9,39-19,39 12,93 14387

Concluzii

Dupa indepartarea componentilor matricei biologice devina posibila folosirea deplina a avantajelor oferite de spectrometria de masa de inalta rezolutie HRMS:

• posibilitatea injectarii fara splitare dar fara contaminarea coloanei cromatografice si a sursei de ioni;
• obtinerea unor limite de detectie foarte joase;
• rezultate de confirmare mult mai bune.

In cazul confirmarii Clenbuterolului prezent in urina in concentratii joase, reextractia probei si prelucrarea fazei apoase clorhidrice reduce mult background-ul biologic, iar aplicarea spectrometriei de masa de inalta rezolutie imbunatateste spectaculos limita de detectie.

Abstract

 Upon screening identification, HRMS confirmation of a positive case is done by reanalysis of the urine sample, where a specific purification procedure is used to selectively isolate the substance in question and its metabolites. The reasons for the necessity of adequate purification techniques, which could give unequivocal evidence of the abuse of anabolic steroids, are the following:

• the urine concentration of the substances in question is very low, often near the detection limit;
• urine samples prove to be such complex matrix that interferences of the biological background affect strongly the GC/MS-Q detection.

For the confirmation of Clenbuterol abuse the biological background is greatly reduced by sample reextraction and hydrochloric phase preparation so that HRMS analysis decreases dramatically the detection limit.

Bibliografie

1.  Schänzer, W.; Delahaut, P.; Geyer, H.; Machnik, M.; Horning, S., Long-term Detection and Identification of Metandienone and Stanozolol Abuse in Athletes by Gas Chromatography-High-Resolution Mass Spectrometry. J.Chromatography B, 687 (1996) 93

2.  Ayotte, C., Clenbuterol: Screening and Confirmation. In: 10th Cologne Workshop on Dope Analysis June 1992 - Proceedings, Köln, Ed. Sport & Buch Strauß, 1993, pag. 185-196.

3.  Thieme, D.; Grosse, J.; Lang, R.; Mueller, R.,K., Application of High-Resolution-MS and Tandem-MS to the identification of anabolic agents. In: Recent Advances in Doping Analysis (vol.3), Köln, Ed. Sport & Buch Strauß, 1996, pag. 285-297.

4.  Sigmund, G.; Horning, S.; Seinsch, I.; Schänzer, W., Confirmation of Clenbuterol-Reextraction with Hydrochloric acid. In: Recent Advances in Doping Analysis (vol.5), Köln, Ed. Sport & Buch Strauß, 1998, pag. 129-133.

5.  Machnik, M., Geyer, H.; Horning, S., Breidbach, A., Delahaut, P., Schänzer, W., Long-term Detection of Clenbuterol in Human Scalp Hair by Means of Gaschromatography/High Resolution Mass Spectrometry (GC/HRMS). In: Recent Advances in Doping Analysis (vol.6), Köln, Ed. Sport & Buch Strauß, 1999, pag. 31-35.

6.  The World Anti-Doping Code, International Standard for Laboratories. ver 3.0, June 2003

Figura 1. Schema de reextractie pentru confirmarea Clenbuterolului

Figura 2. Confirmarea Clenbuterolului prin GC/HRMS