 |
 |
 |
 |
SCREENING-UL STEROIZILOR ANABOLICI ANDROGENI PRIN SPECTROMETRIE DE MASA DE INALTA REZOLUSIE (HRMS)
Ileana VAJIALA, Graziela VAJIALA, Mia LAMOR
Institutul Nasional de Cercetare pentru Sport
Keywords: high resolution mass spectrometry (HRMS); screening; anabolic androgenic steroids
Cuvinte cheie: spectrometrie de masa de inalta rezolusie (HRMS); screening; steroizi anabolici androgeni
Rezumat
Varietatea steroizilor endogeni si sintetici utilizasi ca substanse dopante, cu structuri si proprietasi chimice similare (incluzand derivatizarea, proprietasile cromatografice si fragmentarea) necesita criterii de identificare specifice. In Laboratorul de Control Doping toate probele de urina sunt analizate pentru steroizi anabolici androgeni (SAA) prin tehnica cromatografiei de gaze cuplata cu spectrometria de masa cu filtru quadrupol (GC/MS-Q), de joasa rezolusie. Dupa instalarea, in iunie 2003, a unui echipament de inalta rezolusie ThermoFinnigan, laboratorul a dezvoltat metoda screening prin rezolusie inalta (HRMS), pe un domeniu restrans de agensi anabolici eliminasi in urina la limite de detecsie mai joase decat cele detectabile prin GC/MS-Q.
Introducere
Conform Codului Mondial Antidoping, analiza Screening reprezinta procedura de testare analitica avand scopul de a identifica probele suspecte privind prezensa unei substanse interzise, a unui metabolit al acesteia sau a unui indicator de metoda sau substansa interzisa, si care necesita o testare suplimentara de confirmare [1].
In Laboratorul de Control Doping toate probele de urina sunt analizate pentru steroizi anabolici androgeni (SAA) prin tehnica cromatografiei de gaze cuplata cu spectrometria de masa cu filtru quadrupol de joasa rezolusie (GC/MS-Q) care permite screening-ul unui numar de 44 steroizi anabolici androgeni de interes, oferind sensibilitate inalta si scanare rapida la intervale de milisecunde, separand usor ioni care difera cu o unitate de masa.
Cromatografia de gaze cuplata cu spectrometria de masa cu dubla focalizare este o tehnica analitica de inalta rezolusie (GC/HRMS). Noul echipament instalat in laborator in iunie 2003 este compus din cromatograf de gaze Agilent Technologies GC 6890N cuplat cu spectrometru de masa cu dublu sector MAT 95XP ThermoFinnigan. Dubla focalizare a ionilor este realizata prin combinarea campurilor electrostatice si magnetice ceea ce permite determinari de mase foarte exacte, cu separarea ionilor diferisi dar avand aceiasi masa nominala [2]. Modul de operare prin detecsia mai multor ioni (MID) se realizeza prin varierea ciclica a campului electric, mensinand campul magnetic constant pe o masa data („lock mass"), de regula a unui ion al unui compus de referinsa [3,4]. Scanarea electrica nu este potrivita pentru monitorizarea ionilor avand mase mici dar acopera usor mase mai mari de 300 u.a.m. [4].
Materiale si metode
Metoda a fost dezvoltata pe un amestec de standarde de steroizi anabolici androgeni si metabolisi ai acestora, adaugasi unei matrici biologice similare unei probe de control doping, concentrasia compusilor de interes fiind de 100ng/mL proba. S-a adaugat standard intern de metiltestosteron in concentrasie de 500ng/mL proba. Substansele de referinsa sunt de proveniensa NARL Australia sau sunt preparate la Laboratorul Doping din Köln.
Prelucrare probe Pentru screening HRMS se foloseste aceiasi proba preparata pentru analiza GC/MS-Q, prelucrata dupa metodologia de extracsie a urinei pe fracsia combinata, hidroliza si derivatizare prin trimetilsililare, procedura pusa la punct in cadrul Laboratorului de Control Doping din INCS, descrisa in lucrari stiinsifice anterioare [5,6].
- Gaz purtator: Heliu, 0,7mL/min;
- Injector: Temperatura 3000C, injecsie cu splitare 1:10;
- Program de temperatura: 1750C (0min), 50C/min. pana la 2350C (0min), 200C/min. pana la 3100C (2min);
- Tensiunea multiplicatorului de electroni: 2,0kV;
- Rezolusia: 3000-5000;
- Mod de operare: detecsia mai multor ioni (MID).
Rezultate si discusii
Pentru realizarea screening-ului steroizilor anabolici androgeni prin HRMS s-a dezvoltat o metoda MID ce consine 6 ferestre de timp, fiecare grup avand intre 10 si 12 ioni monitorizasi (Tabel 1), aparsinand la 21 de compusi steroidici si metabolisi. In general au fost selectate fragmente ionice cu mase mai mari de 300 u.a.m. Rezolusia a fost aleasa astfel incat sa furnizeze cel mai bun compromis intre sensibilitate si selectivitate.
In figura 1 prezentam modul de raportare a rezultatelor unei analize screening HRMS pentru un amestec de standarde, raport realizat cu ajutorul programelor software Xcalibur. Se observa ca pentru fiecare agent anabolic s-au ales cel pusin 2 fragmente de masa caracteristice, pentru unii compusi (Epimetendiol, diolii 5 alfa si 5 beta, Clostebol, Stanozolol, Tetrahidrocanabinol) introducandu-se si ioni ai steroizilor endogeni, cu timpi de retensie apropiasi dar mase diferite, ceea ce permite interpretarea rapida si sigura a analizei.
La analiza de rutina a probelor de control doping prin screening pe GC/MS-Q, pot apare semnale caracteristice fragmentelor de masa ale substanselor de interes care sa nu intruneasca in totalitate criteriile de identificare stabilite prin documentele tehnice ale Standardului Internasional pentru Laboratoare elaborat de Agensia Mondiala Antidoping [1], si anume timpul de retensie in coloana cromatografica sa nu difere cu mai mult de 1% fasa de o proba consinand substansa de referinsa, iar la detecsia prin spectrometria de masa, modul de achizisie SIM, 3 ioni specifici sa prezinte un raport caracteristic al abundenselor si sa se incadreze in intervalele de toleransa stabilite pentru intensitasile lor relative. Pentru raportarea de rezultate corecte in cazul acestor probe, este necesara reinjectarea lor pe GC/HRMS.
|
Exemplificam pe o proba care a fost declarata suspecta pe Stanozolol in urma analizei GC/MS-Q (Fig.3. Se observa picuri caracteristice metabolitului 3`hidroxi stanozolol, la acelasi timp de retensie cu al compusului de referinsa, dar prezentand un raport al intensitasilor diferit (m/z 560 mult mai mare decat ionul de baza m/z 143). Situasia este posibila datorita elusiei acestui compus intr-o zona cu zgomot intens ceea ce duce la o linie de baza ridicata. Aceiasi proba reinjectata pe GC/HRMS prezinta picuri clare la m/z 545,3414 si 560,3650, fragmentele de masa care au furnizat zgomot de fond redus si intensitate ridicata, proband astfel prezensa metabolisilor Stanozololului. Prin comparasie cu o urina de control s-a estimat o concentrasie de 1,30 ng/mL proba. Rezultatul a fost ulterior confirmat dupa purificarea probei prin cromatografie de imunoafinitate.
O alta problema rezolvata prin spectrometria de masa de inalta rezolusie este cunoscuta interferensa a norandrosteronului cu fragmentele metabolisilor vitaminei E. La doze mari de vitamina E, detecsia norandrosteronului (m/z 405, 420) prin GC/MS-Q este deranjata de coelusia metabolisilor acesteia (m/z 422), chiar daca exista o diferensa intre masele derivasilor bis-TMS [7]. Prin GC/HRMS, modul de operare MID, ionul molecular al norandrosteronului bis-TMS, [M]=420,2879 (Timp de retensie 8,01min.) si fragmentul de masa provenit din metabolitul vitaminei E bis-TMS, [M]=422,2308 (Timp de retensie 7,98min.), nu se influenseaza reciproc la rezolusii intre 3000 si 5000 (Fig.2)
Concluzii
Metoda pusa la punct in cadrul Laboratorului de Control Doping, Screening prin HRMS, completeaza dar nu inlocuieste screening-ul efectuat pe GC/MS-Q, permisand retrospectivitatea abuzului de steroizi anabolici androgeni.
Screening-ul prin rezolusie inalta se aplica pe un domeniu restrans de agensi anabolici eliminasi in urina dar permite identificarea acestor compusi la limite de detecsie mai joase decat prin GC/MS-Q.
Prin masurarea maselor pe un domeniu ingust este posibila discriminarea semnalului background-ului sau al coeluansilor de fragmentele substanselor de interes, ceea ce duce la:
- reducerea spectaculoasa a limitei de detecsie (sub 2ng/ml proba);
- identificarea metabolisilor substanselor de interes pe o perioada indelungata dupa sistarea utilizarii;
- eliminarea interferensei metabolisilor vitaminei E cu urmele de norandrosteron.
Metoda permite monitorizarea a 21 steroizi si metabolisi prezensi in probele biologice in concentrasii mai mici de 2ng/ml proba.
Abstract
The large variety of endogenous and synthetic steroids used as doping agents in sport, having similar structures and chemical properties (including derivation, chromatographic properties and fragmentation) require specific identification criteria. In Doping Control Laboratory all the routine urine samples are screened for anabolic androgenic steroids by low-resolution technique of gas chromatography coupled with mass spectrometry with quadruple filter (GC/MS-Q). Since the Doping Control Laboratory has been equipped, in June 2003, with the new high resolution ThermoFinnigan equipment, a new HRMS screening method was developed for a selected range of anabolic agents at detection levels lower than those attained with GC/MS-Q.
Bibliografie
1.The World Anti-Doping Code. International Standard for Laboratories, ver 3.0, June 2003.
2. Horning, S.; Schänzer, W., Steroid Screening Using GC/HRMS. In: Recent Advances in Doping Analysis (vol.4), Köln, Ed. Sport & Buch Strauß, 1997, pag. 261-270
3. Trout, G.; Soo, S.; Kazlaukas, R., A Single Screen for Steroids using HRMS. In: Recent Advances in Doping Analysis (vol.7), Köln, Ed. Sport & Buch Strauß, 1999, pag. 249-254.
4. Horning, S.; Schänzer, W., Basics of High Resolution Mass Spectrometry. In: Recent Advances in Doping Analysis (vol.4), Köln, Ed. Sport & Buch Strauß, 1997, pag. 253-260
5. Vajiala, G.; Lamor, M., Sistem computerizat GC/MS Hewlett Packard utilizat in analiza doping a sportivilor de performansa. „INGIOMED 2001". La a II-a Conferinsa de Inginerie Biomedicala cu particiare internasionala, Bucuresti, 13-14 dec.2001
6. Vajiala, G.; Lamor, M.; Subasu, R., Influence of benzbromarone on steroid profile parameters and renal excretion of anabolic steroids. In: Romanian Biotechnology Letters, vol.6, nr.4, 2001, pag.333-341
7. Thieme, D.; Grosse, J.; Lang, R.; Mueller, R.,K., Application of High-Resolution-MS and Tandem-MS to the identification of anabolic agents. In: Recent Advances in Doping Analysis (vol.3), Köln, Ed. Sport & Buch Strauß, 1996, pag. 285-297
 |
 |
