 |
 |
 |
 |
SCREENING-UL SI CONFIRMAREA SUBSTANTELOR DIN CLASA STIMULENTELOR GREU VOLATILE SI A NARCOTICELOR
Ruxandra SUBASU, Carla DONE, Georgeta BICAN,
Graziela VAJIALA, Mia LAMOR
Laboratorul Doping – Institutul National de Cercetare pentru Sport
Cuvinte cheie: screening, confirmare, stimulente, narcotice,GC/MS
Keywords: screening, confirmation, narcotics, GC/MS
Rezumat
Lucrarea prezinta metodologia de identificare si confirmare a stimulentelor greu volatile si narcoticelor prin utilizarea cromatografiei de gaze cuplata cu spectrometria de masa (GC/MS ). Prelucrarea probelor se bazeaza pe un procedeu de hidroliza acida urmat de extractia lichid – lichid a principiilor active cu un solvent organic la pH bazic. Tehnica GC/MS permite identificarea stimulentelor greu volatile si a narcoticelor prin stabilirea parametrilor caracteristici acestora: timp de retentie, spectrul de masa si abundenta relativa a ionilor caracteristici. Prin aceasta metoda se realizeaza screening-ul si confirmarea a peste 15 stimulente greu volatile si narcotice precum si a unor metaboliti ai acestor compusi care sunt introdusi pe lista de substante interzise de Agentia Mondiala Anti-Doping pentru sportivii de performanta.
Introducere
Narcoticele sunt incluse la sectiunea S7 a Standardului International din 2005 [1]. Termenul „narcotic" provine din cuvantul grecesc inconstienta si se referea initial la substantele care amorteau simturile si calmau durerile. Astazi, narcoticele sunt utilizate pentru calmarea durerii, impotriva tusei, diareei si in anestezii. Ele pot induce senzatii de euforie, invincibilitate precum si iluzia de curaj sportivilor. Sportivii care folosesc astfel de substante isi asuma enorme riscuri deoarece acestea au diferite efecte adverse: somnolenta, deteriorarea capacitatii psihice, dilatarea vaselor de sange subcutanate care provoaca inrosirea fetei si gatului, constipatie, stare de voma, depresii respiratorii si in timp pot avea efecte devastatoare asupra organismului [2].
In conformitate cu cerintele Standardului International pentru Laboratoare elaborat de Agentia Mondiala Antidoping, limita de performanta ceruta pentru substantele din clasa stimulentelor greu volatile si narcoticelor este de 200ng·mL-1. Pentru probele suspecte pe morfina, sunt declarate pozitive numai cele care prezinta o concentratie mai mare de 1microg·mL-1, exceptand cazurile in care aceasta provine din metabolizarea codeinei, care nu reprezinta o substanta interzisa. Raportul codeina/morfina se afla pe lista de monitorizare a documentului mentionat [1]
Materiale si metode
Pentru punerea la punct a metodei s-au utilizat solutii etalon obtinute din materiale de referinta certificate de etamivan, fenilefrina, hidrocodona (procurate de la SIGMA, Germania), modafinil (MATRIX, India), Fentanyl (LGC Promochem), fentermina, cocaina, metilefedrina, catina, efedrina, etilefrina, metilfenidat, metadona, codeina, morfina, dextromoramida, pemolina, de concentratie 1mg·mL-1, pseudoefedrina de concentratie 2.5mg·mL-1si benzoilecgonine de concentratie 10mg·mL-1 (procurate de la NARL, Australia). Din aceste solutii s-a preparat un amestec de calibrare de concentratie 50microg·mL-1. Pentru determinarea adrafinilului, bromantanului si a metabolitilor acestora s-au utilizat urini de referinta obtinute prin administrarea de medicamente la subiecti voluntari si recoltarea probelor de urina la anumite intervale de timp.
Existenta unor compusi diferiti ce se determina fie nederivatizati, fie derivatizati a impus utilizarea a doua standarde interne: diisopropilaminododecan, DIPA 13 de concentratie 100microg·mL-1 (pentru compusii ce se determina nederivatizati, procurat de la Koeln, Germania) si norefedrina , de concentratie 25microg·mL-1 (pentru compusii ce se determina derivatizati, procurata de la NARL, Australia).
Prepararea probelor
2.5mL de urina sunt supusi procedeului de hidroliza acida urmata de extractie lichid-lichid in tert-butil-metil-eter si tert-butanol la un pH bazic [3,4]. Concentrarea extractelor biologice se realizeaza la block-heater in atmosfera de azot la o temperatura de pana la 40ºC. Reziduul este reluat cu 150 microL metanol iar apoi repartizat in doua fractii in proportie de 1:2 (v:v) pentru cele doua tipuri de compusii ce urmeaza a fi determinati (derivatizati si nederivatizati). Derivatizarea se realizeaza cu MSTFA(2,2,2-Trifluoro-N-metil N-(trimetilsilil)-acetamid):Acetonitil (9:1) [5,6]. Cele doua fractii vor fi injectate pe rand in gazcromatograful Hewlet-Packard 6890 [7].
Aparatura
Analizele se realizeaza cu un echipament Hewlet-Packard gaz-cromatograf 6890 cuplat cu un spectrometru de masa 5972, avand o coloana capilara HP-5MS 5% fenilmetilsiloxan (25m x 0.25mm i.d., 0.25microm grosimea filmului). Temperatura portului de injectie a gaz-cromatografului este de 300 ºC; debitul gazului purtator Heliu 0.8mL/min; modul de injectare este cu splitare 10:1. Programul de temperatura al cuptorului porneste de la 100ºC cu o rata de crestere de 20ºC/min pana la 310ºC unde sta 5 minute. Modul de identificare al substantelor monitorizate este SIM (monitorizarea ionului selectat).
Rezultate si discutii
Majoritatea substantelor investigate in screening 2 sunt excretate in urina sub forma conjugata. Pentru obtinerea lor in stare libera se realizeaza o hidroliza acida la temperatura de 100ºC.
Pentru punerea la punct a metodei s-a preparat o urina standard (SN) dintr-o urina negativa la care s-a adaugat amestecul de calibrare, concentratia finala a fiecarui compus este de 200ng·mL-1. Initial acesta a fost injectat in aparatul GC/MS in modul de achizitie full scan (scanare completa). Pentru fiecare compus a fost determinat timpul de retentie precum si ionii acestuia, alegandu-se astfel minim 2 - 3 ioni caracteristici care au o abundenta mai mare de 5%. Tabelul 1 prezinta parametrii analitici caracteristici fiecarei substante din amestecul de calibrare.
Tabel 1. Parametrii caracteristici analizei de confirmare a stimulentelor greu volatile si narcoticelor GC/MS
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
In figura 1 (a si b) este prezentata cromatograma unei urini standard (SN) obtinuta dintr-o urina negativa la care s-a adaugat amestecul de calibrare, concentratia finala a fiecarui compus fiind de 200ng·mL-1. Prezenta fenterminei(1, 1b) si metilfenidatului(6,6b) poate fi identificata atat in fractiunea de compusi nederivatizati cat si in cea de compusi derivatizati ea putandu-se gasi sub ambele forme. Cocaina (4) este singurul compus din cei investigati care se pot identifica numai in forma nederivatizata dar in ambele fractii.
 |
 |
Prin administrarea de medicamente la subiecti voluntari s-au obtinut urinile de referinta ale adrafinilului (fig.2) si bromantanului determinandu-se metabolitii substantelor active. Metabolitul M1 al bromantanului se poate identifica atat in fractia libera cat si in cea conjugata(fig.3).
 |
 |
Concluzii
S-a elaborat metoda pentru screeningul si confirmarea a peste 15 substante apartinand clasei stimulentelor greu volatile si narcoticelor, din lista de substante interzise emisa de Agentia Mondiala Anti-Doping pe 2005.
Efectuarea studiilor de excretie pe subiecti voluntari a permis identificarea metabolitilor adrafinilului si bromantanului.
Posibilitatea de a identifica acelasi compus atat in fractia libera cat si in cea conjugata dupa numere de masa diferite reprezinta o modalitate de verificare a calitatii rezultatului.
Abstract
The paper describes the methodology of identification and confirmation of heavy volatile stimulants and narcotics by using gas chromatography coupled with mass spectrometry. Sample preparation is based on acid hydrolyze proceeding followed by the liquid – liquid extraction of the active principle with an organic solvent at alkaline pH. The GC-MS technique permits us the identification of the retention time, characteristic mass spectrum as well as the relative abundance of the specific ions for heavy volatile stimulants and narcotics. The method is able to realize the screening and confirmation of more than 15 heavy volatile stimulants and narcotics as well as some of the metabolites of these substances.
Bibliografie
1. 2005 WADA Prohibited List – International Standard
2. www.usdoj.gov/dea/concern/narcotics.html
3. HEMMERSBACH, P.; DE LA TORRE, R. Stimulants, narcotics and ss-blockers: 25 zears of development in analztical techniques from doping control. Journal of Chromatographz B, vol 687 (1996), p.221-238
4. STRANO, R.S.; MOLAIONI, F.; BOTRE, F. Application of Solid Phase Microextraction for determination of Stimulants, Narcotics and other Doping Agents excreted free in urine. Recent Advances in Doping Analzsis (vol 12), Koeln, Ed. Sport & Buch Strauss, 2004, p.335-340.
5. DEHIATI, S.H.; HAPSARI, A.; ROSALINA, L. Gas Chromatographic – Mass Spectrometric Identification of Codeine, Morphine, and 6-Monoacethzl Morphine in Human Urine as Trimethylsilyl Derivatives. Recent Advances in Doping Analzsis (vol 12), Koeln, Ed. Sport & Buch Strauss, 2004, p.415-420.
6. BAEZ, G.H.; CAMARGO, C.G. The occurrence of Cocaine and Metabolites in Hair of Drug Abusers. Possible Determination of Cut-Off values. Recent Advances in Doping Analzsis (vol 7), Koeln, Ed. Sport & Buch Strauss, 1999, p.371-376.
7. VAJIALA, G.;LAMOR, M., Sistem computerizat GC/MS Hewlett Packard utilizat in analiza doping a sportivilor de performanta."INGIOMED 2001". La a II-a Conferinta de Inginerie Biomedicala cu participare internationala, Bucuresti, 13-14 dec.2001
