DETECTIA 1–TESTOSTERONULUI PRIN TEHNICA GC/MS

Mihaela TONE, Graziela VAJIALA, Mia LAMOR, Ileana VAJIALA

Institutul National de Cercetare pentru Sport, Laboratorul de Control Doping

Cuvinte cheie: 1-testosteron, identificare, GC/MS

Keywords: 1-testosteron, identification, GC/MS

Rezumat

Lucrarea prezinta metodologia de identificare prin tehnica GC/MS a compusului steroidic 1-Testosteron, care din ianuarie 2005 a fost introdus pe lista substantelor interzise de Agentia Mondiala Anti-Doping, in sectiunea S1. Identificarea 1-Testosteronului s-a realizat prin compararea parametrilor caracteristici (timp de retentie, timp relativ de retentie, spectru de masa) ai compusului de interes, cu materialul de referinta certificat. S-a realizat, de asemenea, un studiu de excretie pe un subiect voluntar de sex masculin, in urma caruia s-au identificat urmatorii produsi de metabolizare: 1-Androsteron, 1-Androstendiol si 1-Androstendiona, compusi care au fost introdusi in screening-ul de rutina pentru identificarea steroizilor anabolici androgeni.

Introducere

1-Testosteronul (1-T), 17beta-hidroxi-androst-1-en-3-ona este un compus steroidic, care din punct de vedere structural este foarte asemanator cu testosteronul (T), singura diferenta constand in pozitia dublei legaturi (figura 1). Studii de literatura au relevat un efect anabolic crescut al acestui compus, ceea ce a condus la introducerea acestuia pe lista substantelor interzise de Agentia Mondiala Anti-Doping[1], incepand cu 1 ianuarie 2005, in sectiunea S1- Agenti anabolici.

Figura1. Structurile chimice ale 1-Testosteronului (a) si Testosteronului (b) Din acest motiv ne-am propus stabilirea metodei de depistare a 1-T si efectuarea unui studiu de excretie pentru identificarea metabolitilor acestuia.

Identificarea 1-T s-a realizat prin compararea timpului de retentie si a spectrului de masa al 1-T din urina de referinta cu cel al unui material de referinta certificat.

Materiale si metode

S-au administrat 2 tabletex25mg 1-Testosteron unui subiect de sex masculin si s-au recoltat probe de urina la 8, 17 si respectiv 24 ore de la administrarea medicamentului. Inainte de administrare a fost recoltata o proba blanc. A fost utilizat material de referinta certificat pentru 1-Testosteron, procurat de la Steraloids.

Prepararea probelor

Probele de urina au fost prelucrate si analizate prin metoda cromatografiei de gaz cuplata cu spectrometria de masa, conform procedurii standard pentru steroizii anabolici fractii combinate, pusa la punct in cadrul Laboratorului de Control Doping [4]. Extractia compusilor steroidici din probele biologice de urina implica hidroliza enzimatica cu beta-glucuronidaza (E.coli), extractia lichi-lichid cu tert-butilmetil- eter si in final derivatizarea extractului uscat cu 100μL amestec de derivatizare: MSTFA/NH4I/Etantiol (1000:2:3; v:w:v), 20min. la 60ºC.

Parametrii GC/MS

Rezultate si discutii

Figura 2. Structurile chimice ale (a) 1-Androsteronului, (b) 1-Androstendiolului, (c) 1-Androstendionei.

In urma analizei screening a probelor de urina obtinute din studiul de excretie au fost identificati atat medicamentul nemodificat cat si o compusii de metabolizare ai acestuia, ale caror structuri sunt prezentate in figura 2. In cromatograma totala de ioni prezentata in figura 3 se poate observa un pic la timpul de retentie TR=14.90 min., caruia ii corespunde spectrul de masa din figura 4a. Prin comparare cu timpul de retentie si spectrul de masa al standardului de 1-Testosteron (figura 4b) s-a stabilit ca acest pic corespunde medicamentului nemodificat.

Figura 3. Cromatograma totala de ioni corespunzatoare probei prelevate la 8h de la administrare: (1) Androsteron; (2) Etiocolanolon; (3) 1-Androsteron; (4) 1-Androstendiol; (5) 1-Adrostendiona; (6) 1-Testosteron; (7) SI- Metiltestosteron.

Figura 4. Spectrul de masa caracteristic (a) 1-Testosteronului din urina de referinta; (b) 1-Testosteronului ca material de referinta certificat.

Datele de literatura au prezentat ca un posibil metabolit al 1-Testosteron este 1-Androstendiona [2,3] al carui spectru de masa este redat in figura 5.

Figura 5. Spectrul de masa caracteristic diTMS-1-androstendiona din urina de referinta In figurile 6 si 7 sunt prezentate spectrele de masa corespunzatoare altor 2 posibili metaboliti ai 1-Testosteronului: 1-Androsteron si 1-Androstendiol, picul 3 si respectiv 4 din figura 3.

In figurile 6 si 7 sunt prezentate spectrele de masa corespunzatoare altor 2 posibili metaboliti ai 1-Testosteronului: 1-Androsteron si 1-Androstendiol, picul 3 si respectiv 4 din figura 3.

Prin metoda pusa la punct in cadrul Laboratorului de Control Doping s-a reusit separarea gaz cromatografica a Etiocolanolonului (picul 2) de 1-Androsteron (picul 3).

Toate datele analitice care caracterizeaza acesti compusi au fost sintetizate sub forma tabelului 1.

Compus TR (min) TRR* Fragmente de masa caracteristice 1-Androsteron 13,99 0.8176 432; 417; 327 1-Androstendiol 14,52 0.8541 419; 434 1-Androstendiona 14,63 0.8605 415; 430; 194 1-Testosteron 14,91 0.8764 194; 432; 417 *SI: Metiltestosteron (TR=17.00)

Tabel nr.1 Caracterizarea analitica a 1-Testosteronului si metabolitilor sai

Concluzii

Abstract

This paper presents the methodology for the detection by the GC/MS technique of the steroid compound 1-Testosteron, which included since January 2005 in the WADA Prohibited List, Section S1. The identification of the 1-Testosteron was performed by comparing the characteristic parameters (retention time, relative retention time, mass spectrum) of the compound with those of a certified reference material. Also, by an excretion study performed on a male volunteer, the following metabolites were identified: 1-Androsterone, 1-Androstendiol and 1-Androstendione, compounds which were also introduced in the routine screening for the identification of the anabolic androgenic steroids.

Bibliografie

1. *** Lista substantelor interzise pe 2005, Agentia Mondiala Anti-Doping.

2. ZHANG YINONG; LIU XIN; WU MOUTIAN; WANG JINGZHU; ZHANG HUYUE, Analitical Data of 1-Testosterone and the Preliminary Results of Excretion Study with 1-Testosterone. In Donike m.; Geyer H.; Gotzmann a.; Mareck-Engelke U.; Rauth S. (eds), Procedings-22th Cologne Workshop on Dope Analysis 7th to 12th March 2004, Sport und Buch Straub, Koln 2004, 81-90.

3. JAIN, S.; BEOTRA, A.; KAUR, T., A Case Study: Detection of 1-Testosterone in Urine by GCMSD. Poster in the 23th Cologne Workshop on Dope Analysis 7th to 12th March 2005, Koln

4. VAJIALA, G.; LAMOR, M.; CHITIMIA, B., Benzbromarone, a Possible Masking Agent of Anabolic Androgenic Steroids (2), In Donike m.; Geyer H.; Gotzmann a.; Mareck-Engelke U.; Rauth S. (eds), Procedings-19th Cologne Workshop on Dope Analysis 18th to 23th March 2001, Sport und Buch Straub, Koln 2001, 233-238.