 |
 |
 |
 |
ANALIZA HIDROXIETILAMIDONULUI IN CONTROLUL DOPING
Ileana VAJIALA, Mihaela TONE, Graziela VAJIALA, Mia LAMOR
Institutul National de Cercetare pentru Sport
Cuvinte cheie: hidroxietilamidon (HES); cromatografie de gaze/spectrometrie de masa;
Keywords: hydroxyethyl starch (HES); gas chromatography/mass spectrometry;
Rezumat
Substituentii de plasma (albumina umana, dextran, hidroxietilamidon) au fost introdusi pe lista substantelor interzise in sport din ianuarie 2000. In scopuri terapeutice, hidroxietilamidonul (HES) este administrat in toate cazurile de pierderi de sange (arsuri, socuri hipovolemice, stabilizarea circulatiei). Este folosit abuziv de catre sportivi pentru unele avantaje, de exemplu controlul valorii hematocritului sau cresterea cantitatii de fluide corporale, prevenind scaderea performantei prin deshidratare. Metoda rapida pentru identificarea HES in probele de urina supuse controlului doping se bazeaza pe o reactie de hidroliza acida prin care polizaharidul se transforma in principal in glucoza si 2-, 3- si 6-hidroxietilglucoza, cu izomerii alpha- si beta- corespunzatori. Monozaharidele formate sunt identificate sub forma de derivati per-TMS prin cromatografie de gaze/spectrometrie de masa.
Introducere
In scopuri medicale substituentii de plasma se folosesc in tratamentul hemoragiilor sau socurilor hipovolemice, precum si pentru crioprotectia materialelor biologice. Aceasta clasa de substante include structuri proteinice (gelatina, albumina umana), polimeri ai hidratilor de carbon intalniti in mod natural (dextran) si polizaharide modificate chimic (hidroxietilamidon). Acesta din urma in mod special este folosit pe scara larga datorita reactiilor adverse limitate si a timpului de injumatatire care poate fi atent controlat pe baza gradului de substitutie molara, permitand astfel prescrierea timpului in care remediul are efect.
Hidroxietilamidonul este folosit abuziv de catre sportivi pentru a preveni deshidratarea, sporind astfel rezistenta. Folosit singur sau combinat cu eritropoietina recombinanta prezinta avantajul obtinerii unui volum crescut de sange si hemoglobina, in timp ce nivelul hematocritului ramane in limite legale
[1,2]. Ca rezultat, HES si ceilalti substituenti de plasma mentionati au fost inclusi pe lista substantelor interzise in sport incepand cu ianuarie 2000. In consecinta, pentru analiza HES s-au dezvoltat 2 metode analitice bazate pe cromatografie de gaze cuplata cu spectrometria de masa [3,4,5,6]. Ulterior au fost propuse si alte metode de analiza a acestor compusi polari, cum ar fi LC/MS/MS [7], spectrometria de masa MALDI TOF [2], metode colorimetrice si enzimatice [8].
Pentru inlocuirea volumului intravascular se folosesc solutiile de HES, coloizi artificiali derivati de amilopectina din amidon de porumb. Caracteristicile principale ale hidroxietilamidonului sunt masa moleculara medie, substitutia molara (mol resturi hidroxietil per mol subunitati glucoza) si raportul C2/C6 (modul de substituire al atomilor de carbon din subunitatile de glucoza) [8].
 |
Heterogenitatea moleculei explica metabolismul complex si dinamic prin care se formeaza molecule noi dar mai mici de HES, distribuite in organe sau excretate in urina sau bila. Studii de excretie [9] au aratat ca eliminarea HES variaza puternic de la un subiect la altul in ceea ce priveste concentratia maxima (1 la 75 mg/mL) si timpul de detectie (intre 8 si 18 zile).
Structura de baza a HES (fig.1) arata un polimer de alpha-D-glucoza legat in pozitiile 1,4 cu un grad de ramificare de aproximativ 6% la pozitia C6 (spre deosebire de polizaharidul natural dextran legat in pozitiile 1,6 si grad de ramificare 7% la C3, C4) [1,3,6].
Tinand cont de capacitatile disponibile pentru analiza GC/MS, dintre metodele analitice mai sus mentionate, Laboratorul de Control Doping a dezvoltat metoda rapida de screening prin GC/MS pentru detectia HES in probele de urina supuse controlului doping, metode ale carei rezultate sunt prezentate in continuare.
Materiale si metode
Metoda a fost dezvoltata pe o proba de urina de referinta obtinuta de la un pacient tratat cu HES si pe urina negativa imbogatita cu solutie standard de HES – HETASTARCH, sol. 6% in 0,9% NaCl- de provenienta SIGMA. S-a folosit standard intern de manitol modificat izotopic 13C1-Manitol, provenit de la Cambridge Isotope Laboratories, S.U.A.
Prelucrare probe: Schema de preparare a probelor, prezentata in figura 2, urmeaza metoda screening dezvoltata de Thevis et al. [4,5]. Prelucrarea consta intro reactie de hidroliza acida, fara nici o purificare suplimentara a monozaharidelor rezultate. Derivatizarea se efectueaza cu amestec de MSTFA-NH4I-etantiol in prezenta de piridina. S-a folosit standard intern de 13C1-Manitol in concentratie de 50microg/mL.
Parametrii analitici: Derivatii per-trimetilsililati ai monozaharidelor rezultate in urma hidrolizei au fost analizati pe un echipament GC/MS Agilent 6890N/5973 Network, in urmatoarele conditii:
Rezultate si discutii
Hidroliza acida produce in principal in glucoza si 2-, 3- si 6- hidroxietilglucoza, cu izomerii alpha- si beta- corespunzatori. Prezenta iodurii de amoniu in amestecul folosit la derivatizarea acestor monozaharide permite prepararea insitu a trimetiliodsilanului (TMIS), compus foarte sensibil si instabil datorita reactivitatii sale deosebite si care permite o per-trimetilsililare rapida. Figura 3 prezinta cromatograme si spectre de masa ale per-TMSmonomerilor formati. Sunt semnale care arata prezenta a 2 izomeri pentru fiecare monozaharid datorita centrului anomeric de la C1. Cel mai abundent produs de hidroliza este alpha-2 HEG iar fragmentele de masa tipice sunt:
|
Concluzii
Nomenclatura
HES hidroxietilamidon
2-HEG alpha- si beta-2-hidroxietil-glucoza
3-HEG alpha- si beta-3-hidroxietil-glucoza
6-HEG alpha- si beta-6-hidroxietil-glucoza
TMS trimetilsilil
 |
 |
Abstract
Since January 2000 plasma volume expanders (human albumine, dextran, hydroxyethyl starch) belong to the list of prohibited substances in sport. For therapeutic purposes hydroxyethyl starch (HES) is administered in all cases of loss of blood (treatment of burns, hypovolaemic shocks, stabilization of the circulation of blood). It is abused by the athletes for different advantages, e.g., the control of the haematocrit value or higher amounts of body fluid to prevent a decrease in performance because of dehydration. The rapid screening method for HES in doping control urine samples consists of the acidic hydrolysis of the polysaccharide mainly yielding glucose, 2-, 3- si 6-hydroxyethylglucose with alpha- and beta-isomers. These monosaccharides are identified as per-TMS derivatives by gas chromatography/mass spectrometry.
Bibliografie
1. THEVIS, M.; OPFERMANN, G.; SCHANZER, W., Screening and Confirmation Methods for the Detection of Plasma. Volume Expanders in Human Urine. Recent Advances in Doping Analysis (vol.9), Koln, Ed. Sport & Buch Strauss, 2001, pag. 13-17.
2. GUTIERREZ GALLEGO, R.; SEGURA, J., MALDI TOF mass spectrometry screening for the presence of plasma volume expanders in urine. Recent Advances in Doping Analysis (vol.11), Koln, Ed. Sport & Buch Strauss, 2003, pag. 119-128.
3. THEVIS, M.; OPFERMANN, G.; SCHANZER, W., GC/MS-Detection of Hydroxyethyl Starch (HES) in Human Urine. Recent Advances in Doping Analysis (vol.7), Koln, Ed. Sport & Buch Strauss, 1999, pag. 31-40.
4. THEVIS, M.; OPFERMANN, G.; SCHANZER, W., Rapid Screening Method to Detect Hydroxyethyl Starch (HES) in Human Urine. Recent Advances in Doping Analysis (vol.8), Koln, Ed. Sport & Buch Strauss, 2000, pag. 41-46.
5. THEVIS, M.; OPFERMANN, G.; SCHANZER, W., Detection of the plasma volume expander hydroxyethyl starch in human urine. J.Chromatography B, 744 (2000) 345.
6. THEVIS, M.; OPFERMANN, G.; SCHANZER, W., Mass spectrometry of partially methylated alditol acetates derived from hydroxyethyl starch. J. Mass Spectrom., 35 (2000) 77.
7. THEVIS, M.; GUDDAT, S.; SCHANZER, W., Determination of HES, dextran and mannitol in human urine. Recent Advances in Doping Analysis (vol.10), Koln, Ed. Sport & Buch Strauss, 2002, pag. 189-200.
8. AVOIS, L.; LUND, H.,S.; HEMMERSBACH, P.; SAUGY, M., Rapid screening of HES in urine with colorimetric detection. Recent Advances in Doping Analysis (vol.12), Koln, Ed. Sport & Buch Strauss, 2004, pag. 371-376.
9. LUND, H.,S., et al., Excretion studies with hydroxyethyl starch. Recent Advances in Doping Analysis (vol.11), Koln, Ed. Sport & Buch Strauss, 2003, pag. 309-313.
