 |
 |
 |
 |
CONFIRMAREA SALBUTAMOLULUI PRIN LC/MS/MS
Georgeta BICAN, Valentin POP, Graziela VAJIALA, Mia LAMOR
Institutul National de Cercetare pentru Sport, Laboratorul de Control Doping
Cuvinte cheie: beta-2-agonist, LCMS, salbutamol, cuantificare
Keywords: beta-2-agonist, LCMS, salbutamol, quantification
Rezumat
Salbutamolul este un beta-2-agonist utilizat ca bronhodilatator in tratamentul astmului bronsic si astmului indus de efort. Concentratiile de salbutamol in urina (liber si conjugat ca glucuronat) mai mari de 1000ng/ml sunt considerate o incalcare a reglementarilor anti-doping.
Lucrarea descrie o metoda de identificare si cuantificare a salbutamolului in probele de control doping prin cromatografie de lichid cuplata cu spectrometria de masa in tandem cu triplu quadrupol, metoda rapida cu sensibilitate ridicata.
Tranzitiile MRM caracteristice sunt: (-)238 > 218, 220, 190, 106, 163 cu energiile de coliziune specifice, iar curba de calibrare este trasata pe domeniul 800-1200ng/ml.
Introducere
Salbutamolul este unul din cei mai comuni beta-2-agonisti utilizat ca bronhodilatator in tratamentul astmului bronsic/ astmului indus de efort [1]. Conform listei AMAD de substante interzise din 2005, beta-2-agonistii reprezinta sectiunea S3 de substante interzise permanent, atat in competitie cat si in afara competitiei [2].
Prezenta salbutamolului in urina in concentratie mai mare de 1000ng/ml este considerata o incalcare a reglementarilor anti-doping. Concentratia salbutamolului se calculeaza ca suma dintre concentratia substantei libere si a glucuronatului conjugat [3].
Patru beta-2 agonisti administrati prin inhalare, si anume formoterolul, salbutamolul, salmeterolul si terbutalina pot fi autorizati prin Scutire de Uz Terapeutic. In ciuda acordarii Scutirii de Uz Terapeutic, in cazul in care Laboratorul a raportat o concentratie de salbutamol (liber plus glucuronat) mai mare de 1000ng/ml, acest lucru va fi considerat drept un rezultat pozitiv, daca sportivul nu dovedeste ca rezultatul anormal a fost consecinta utilizarii terapeutice a salbutamolului inhalat [2]. Structura chimica a salbutamolului este prezentata in Figura 1.
 |
In general, identificarea si cuantificarea salbutamolului s-a realizat prin cromatografie de gaz cuplata cu spectrometrie de masa [4,5,6,7,8]. Aplicarea acestei tehnici implica ca etapa preliminara derivatizarea extractelor biologice, ceea ce duce la marirea timpului de pregatire a probelor si adauga un plus de incertitudine deoarece molecula de salbutamol contine 4 grupari polare care trebuiesc complet derivatizate, iar temperatura reactiei de derivatizare poate cauza descompunerea partiala a salbutamolului. De aceea, ar fi de preferat o tehnica care sa elimine etapa de derivatizare, precum tehnica LC/MS/MS. Astfel, specialistii Laboratorului Doping de la Koln au dezvoltat metodologia de screening si confirmare a substantelor din clasa beta-2- agonistilor prin LC/ESI-MS/MS in modul de ionizare pozitiv [9]. O data cu achizitia sistemului cromatograf de lichid cuplat cu spectrometru de masa triplu quadrupol, LC/MS/MS Varian 1200L in Laboratorul de Control Doping a fost optimizata metodologia de identificare si cuantificare a salbutamolului, metoda rapida cu sensibilitate ridicata fata de metoda GC/MS utilizata pana in prezent[4].
Materiale si metode
Material de referinta Salbutamol – s-a procurat de la Sigma. S-a preparat o solutie de Salbutamol de concentratie 100ppm.
Standard intern: Mefrusid – s-a procurat de la Bayer. S-a preparat o solutie de SIMefrusid de 10ppm.
Prelucrare probe. Metoda de extractie este similara tehnicii GC/MS folosita anterior [10,11], eliminandu-se etapa de derivatizare si scurtandu-se in acest fel timpul de pregatire a probelor. Dupa evaporarea solventului organic, reziduul este reluat cu 100μl amestec metanol:tampon acetat, 4:1, (v/v).
Parametrii analitici. Analiza a fost efectuata pe sistemul LC/MS/MS Varian 1200L.
|
Rezultate si discutii
Pe baza analizei screening, utilizand monitorizarea reactiilor multiple, s-au stabilit parametrii caracteristici de identificare ai salbutamolului: timpul de retentie, timpul de retentie relativ si tranzitiile specifice compusului, prezentati in Tabelul 1. De asemenea, sunt prezentati parametrii caracteristici de identificare ai standardului intern, SI-Mefrusid. In conditiile noastre de lucru, utilizand parametrii LC/MS/MS mentionati, tR al salbutamolului este 3,64min., tRR fata de standardul intern, SI-Mefrusid, 0,33, iar tranzitiile MRM caracteristice sunt: (-)238 > 218, 220, 190, 106, 163 cu energiile de coliziune specifice (Figura 2). Confirmarea compusului s-a realizat utilizand criteriile de identificare prin cromatografie si spectrometrie de masa; astfel, pentru ca o substanta interzisa sa fie declarata prezenta intr-o proba suspecta, timpul de retentie nu trebuie sa difere cu mai mult de 2% fata de o proba continand substanta de referinta, iar la detectia prin spectrometria de masa, modul de achizitie MRM, trebuie ca 3 ioni de diagnostic sa prezinte un raport caracteristic al abundentelor si sa se incadreze in intervalele de toleranta stabilite fata de substanta de referinta [12].
|
 |
Pentru cuantificarea salbutamolului, s-a trasat curba de calibrare in jurul valorii maxime admise pe domeniul 800-1200ng/ml (Figura 3). Din solutia de salbutamol de 100ppm s-au pipetat 16, 18, 20, 22, 24μl, corespunzatoare nivelelor de calibrare, 800, 900, 1000, 1100, 1200ng/ml proba. Se traseaza curba variatiei factorului de raspuns in functie de concentratia Salbutamolului, curba de regresie liniara cu coeficientul de corelatie 0.9946.
 |
Pentru verificarea validitatii metodei dezvoltate in laboratorul nostru, s-a preparat o proba de urina la care s-a adaugat salbutamol in concentratie de 1000ng/ml. Aceasta sa utilizat drept control de calitate, rezultatul obtinut fiind prezentat in Figura 4.
 |
Concluzii
Abstract
Salbutamol is a beta-2-agonist used as bronchodilator in the treatment of the asthma and of the exercise induced asthma. A salbutamol (free plus glucuronide conjugate) concentration in urine greater than 1000ng/mL is to be considered a doping offense. The paper describes a method for identification and quantification of salbutamol from the doping control samples by the liquid chromatography coupled with the tandem mass spectrometry with triple quadrupol, a rapid method with high sensitivity. The characteristic MRM transitions are: (-)238 > 218, 220, 190, 106, 163 with the specific collision energies, and calibration curve is situates between 800-1200ng/ml.
Bibliografie
1. STROESCU, V., Bazele farmacologice ale practicii medicale. Bucuresti, Ed. Medicala, 1984;
2. Agentia Mondiala Anti-Doping, Lista substantelor interzise pe 2005.
3. Documentul Tehnic AMAD – TD2004MRPL, Limitele minime de performanta cerute pentru detectarea substantelor interzise. versiunea 1.2, 1 ianuarie 2004;
4. VAJIALA, I., LAMOR, M., VAJIALA, G., POP, V., Identificarea si determinarea cantitativa a salbutamolului prin cromatografie de gaz/spectrometrie de masa. Conferinta Stiintifica nationala, Bucuresti, 2002, p.351-356;
5. FORSDAHL, GURO; GMEINER, GUNTER, Quantification and stabilyty of Salbutamol in human urine. J.Sep.Sci. (2004),27, p.110-114;
6. BERGES, R.; SEGURA, J.; DE LA TORRE, X., MAS, M., FARRE, M., FITCH, K.D., MORTON, A.R., UEKI, M., Oral versus inhaled salbutamol: Is distinction possible by urine analysis? In: Recent Advances in Doping Analysis, Koln, Edit. Sport & Buch Strauss, nr. 6, 1998, p.405-419;
7. BELLAHN, I., NOLTEERNSTING, E., OPHERMANN, G., Preliminary results of excretion studies with salbutamol. In: Recent Advances in Doping Analysis, Koln, Edit. Sport & Buch Strauss, nr. 6, 1998, p.489-496;
8. HALATCHEVA, N; DANEVA, E, Some aspects of investigation of extaction, derivatisation and excretion of terbutaline and salbutamol. In: Recent Advances in Doping Analysis, Koln, Edit. Sport & Buch Strauss, nr. 8, 2000, p.189-196;
9. THEVIS, MARIO; OPHERMANN, GEORG; SCHANZER, WILHELM., LC-ESI-MS/MS Screening and Confirmation Methods for ß2-Agonists in Human or Equine Urine. In: Recent Advances in Doping Analysis, Koln, Edit. Sport & Buch Strauss, nr. 11, 2003, p.129-131;
10. VAJIALA, G., LAMOR, M., Sistem computerizat GC/MS Hewwlett Packard utilizat in diagnoza doping a sportivilor de performanta.La a II-a Conferinta de Inginerie Biomedicala cu participare internationala, INGIMED 2001, Bucuresti, 2001;
11. VAJIALA, G., LAMOR, M.,SUBASU, R., Influence of benzbromarone on steroid profile parameters and renal excretion of anabolic steroids. Romanian Biotechnology Letters, vol. 6, nr.4, 2001, p.333-341;
12. Documentul Tehnic AMAD – TD2003IDCR, Criterii de identificare pentru incercarile calitative cuprinzand cromatografia si spectrometria de masa, versiunea 1.2, 1 ianuarie 2004.
