 |
 |
 |
 |
DETECTIA HCG PRIN IMUNOCHEMILUMINISCENTA
Laura FLOARES,
Carla DONE
Ileana VAJIALA
Mia LAMOR
Graziela VAJIALA
Agentia Nationala Anti-Doping
Cuvinte cheie: gonadotropina corionica umana (hCG), imunochemiluminiscenta, principiul sandwich
Keywords: chorionic gonadotropin hormone (hCG), immunochemiluminescent technique, sandwich principle
Rezumat
Hormonul gonadotropina corionica umana (hCG) se afla inclus pe lista interzisa, elaborata de Agentia Mondiala Anti-Doping, ca fiind substanta dopanta pentru sportivii de sex masculin. Gonadotropina corionica umana, hormon glicoproteic, este secretata in mod fiziologic de placenta in timpul sarcinii. Concentratii de hCG-beta in urina mai mari de 5 mUI/ml sunt considerate o incalcare a reglementarilor antidoping.
Lucrarea de fata descrie metoda de detectie a hormonului gonadotropina corionica umana, in probele de urina de control doping, prin imunochemiluminiscenta, precum si un studiu referitor la eliminarea fiziologica a hormonului hCG, fractiunea beta, din urini provenind de la femei, barbati si femei gravide.
Introducere
Hormonul gonadotropina corionica umana se afla inclus pe lista interzisa, elaborata de Agentia Mondiala Anti-Doping, in sectiunea S2 [6]. Deoarece este secretat in mod fiziologic de placenta in timpul sarcinii, este considerat substanta de dopaj numai pentru sportivii de sex masculin.
Gonadotropina corionica umana este un hormon glicoproteic cu o greutate moleculara de 37,9 kDa, compus din 237 de aminoacizi, si este alcatuit din doua subunitati: subunitatea α, comuna tuturor hormonilor glicoproteici (LH, FSH, TSH), si subunitatea beta care ii confera specificitate (considerat marker al activitatii trofoblastice) si o mare stabilitate [5].
Unii sportivi de sex masculin folosesc preparatul farmaceutic al hCG pentru a stimula productia de testosteron inaintea competitiilor si/sau pentru a preveni atrofia sau oprirea activitatii testiculare, in timpul sau dupa administrarea prelungita a androgenilor de sinteza [4]. Consecutiv unor studii efectuate pe loturi mari de sportivi precum si unor evaluari statistice, s-a impus ca limita de dopaj o valoare mai mare de 5 mUI/ml a hormonului gonadotropinei corionice umane [3].
Intrucat hCG este o substanta endogena, a trebuit elaborata o strategie pentru a detecta hormonul hCG de natura exogena [2]. Testele pentru determinarea gonadotropinei corionice umane pot fi efectuate din urina sau ser. In cadrul laboratorului, determinarile s-au efectuat numai din urina, folosind un aparat procurat de la firma Roche, ELECSYS 2010, si utilizand reactivi standardizati. Pe langa detectia hCG cu acest echipament, lucrarea de fata prezinta si un studiu referitor la eliminarea fiziologica a hormonului hCG, fractiunea beta, din urini provenind de la femei, barbati si femei gravide.
Materiale si metoda
Aparatura
Pentru determinarea beta-hCG din probele de urina s-a utilizat aparatul ELECSYS 2010, complet automatizat, procurat de la firma Roche. Partea principala a sistemului este reprezentata de unitatea de detectie. Aceasta contine: un tub fotomultiplicator, peltier, celula de masurare in flux continuu, ansamblul magnetic cu electrozii de lucru din platina si un circuit de amplificare. Temperatura este mentinuta constanta la 28ºC ± 5ºC.
Reactivi si materiale
Reactivii de lucru au fost procurati de la firma Roche, iar acestia contin:
Calibrarea aparatului ELECSYS 2010 se face de cate ori este necesar, utilizand un set de doi calibratori, procurati de la firma Roche si continand hCG in concentratie de 1,5 mUI/ml, respectiv 2000 mUI/ml. Prin analiza acestor 2 concentratii se ajusteaza curba de calibrare, trasata prin 5 puncte, inclusa in programul software al echipamentului. Inaintea efectuarii probelor se verifica buna functionare a sistemului, utilizand un set de doua probe de control, procurat de la firma Roche, avand valori intre 6,94 - 12,88 mUI/ml, respectiv 27,58 - 51,22 mUI/ml.
Principiul metodei
Procedura chimica pentru a detecta hCG cu ELECSYS 2010 se bazeaza pe reactia imuna de electrochemiluminescenta-principiul sandwich. In primul pas al reactiei, se incubeaza, timp de 9 minute, 10µl de proba de urina, impreuna cu anticorpi monoclonali biotinilati specifici anti-hCG si un anticorp monoclonal specific anti-hCG, marcat cu un complex de rutheniu, care reactioneaza formand un complex sandwich. Subunitatea beta a hormonului gonadotropinei corionice umane este considerata a fi antigenul reactiei (fig.1). Se folosesc sarurile de ruteniu, stabile si hidrosolubile, care in etapele ulterioare formeaza chelati responsabili de emisia de lumina initiata electric.
Pentru a doua incubatie (durata 9 minute) sunt adaugate microparticulele de streptavidina avand dimensiuni mari si proprietati magnetice, si care vor forma complexul final prin interactiunea cu biotina, din sandwich-ul format anterior.
Amestecul rezultat este aspirat in celula de masurare a aparatului, unde complexul cu particulele de streptavidina este captat magnetic pe suprafata electrodului de lucru, unde este distribuit uniform. In acesta etapa, tamponul ProCell este folosit pentru a spala suprafata electrodului, a indeparta excesul de reactiv si proba si adaugare de tripropilamina. Substantele care nu fac parte din complex sunt indepartate cu ajutorul reactivului de sistem. Se aplica o tensiune la nivelul electrodului de lucru, care initiaza reactia chemiluminiscenta. Emisia de lumina este masurata de un fotomultiplicator. Sistemul utilizeaza semnalele corespunzatoare pentru calcularea rezultatelor si le include in curba de calibrare obtinuta la inceputul procedurii.
 |
Probe analizate
In cadrul laboratorului, s-a efectuat un studiu referitor la eliminarea fiziologica a hormonului hCG, subunitatea beta, folosind 92 subiecti cu varste cuprinse intre 21 si 34 de ani, de sexe diferite. 86 subiecti au fost barbati, iar sase subiecti au fost femei, dintre care trei gravide. Acestora li s-au recoltat probe de urina in 3 luni diferite de sarcina.
Rezultate si discutii
Referitor la eliminarea fractiunii beta a hormonului hCG se observa ca atat la femei cat si la barbati, in conditii fiziologice normale, valorile sunt foarte apropiate si de obicei sunt sub 1 mUI/ml (Tabelul nr. 1 si figura 2).
Dintre subiectii de sex masculin analizati, 33,72% prezinta valori ale beta-hCG sub 0,100 mUI/ml, 19,76% au valori cuprinse intre 0,101 mUI/ml – 0,199 mUI/ml, 11,62% au valori intre 0,200 mUI/ml – 0,299 mUI/ml si 10,46% au valori cuprinse in intrevalul 0,500 mUI/ml – 0,599mUI/ml.
In urina de femeie gravida (Tabelul nr.2), varful de excretie al hCG-beta este in trimestrul intai de sarcina, dupa care se observa o descrestere a excretiei urinare in cursul celui de-al doilea trimestru de sarcina, urmand sa creasca din nou in al treilea trimestru, dar fara sa atinga valorile din luna a treia.
Tabel nr.1. Concentratii beta-hCG din urini provenind de la subiecti de sex feminin
|
 |
Tabel nr.2. Concentratii beta-hCG din urini provenind de la femei gravide
|
Concluzii
Metoda prin imunochemilumuniscenta cu echipamentul ELECSYS 2010 reprezinta metoda specifica pentru detectia hCG in efectuarea controlului doping.
Valorile hCG obtinute in conditii fiziologice sunt mult sub limita considerata de dopaj in literatura de specialitate.
Ne propunem extinderea cercetarilor prin administrarea de hCG si urmarirea modificarilor profilului hormonilor androgeni.
Abstract
Human chorionic gonadotropin hormone (hCG) is included on the Prohibited List, elaborated by WADA (World Anti-Doping Agency) as doping substance for male athletes. Human chorionic gonadotropin - glycoprotein hormone - is natural produced by placenta during pregnancy. Concentrations of hCG-beta in urine higher than 5 mUI/ml are considered an anti-doping rules violation.
This present work describes a method for human chorionic gonadotropin hormon dectection in doping control urine samples through immunochemiluminescent technique , as well as a study regarding the physiological elimination of fraction beta hCG hormone from urines provided by women, men and pregnant women.
Bibliografie
BUTLER S.A., COLE L.A., CHARD T., ILES R.K., Dissociation of hCG intro its free subunits is dependent on naturally occuring molecular structural variation, sample matrix and storage conditions - Ann Clin Biochem, vol.35, (1998) 754-760
GALLEGO R. GUTIERREZ, LLANELIS R. RAMIREZ, SEGURA J., Recent Advances in Doping Analysis, vol.13, Sport und Buch Strauss, Koln (2005) 275-287
LAIDER PAUL, COWAN DAVID A., HIDER ROBERT C., KICMAN ANDREW T., New Decision Limits and Quality-Control Material for Detecting Humam Chorionic Gonadotropin Mi Misuse in Sports - Clinical Chemistry, vol. 40/7, (1994) 1306-1311
PEREIRA H.M.G., RAMOS S.B.,. DAL SASSO M.A, POCAS E.S.C., DE AQUINO NETO F.R., Study of Endogenous Profile of hCG in Male Brazilian Athletes - Recent Advances in Doping Analysis, vol.13, Sport und Buch Strauss, Koln (2005) 275-287
SAIRAM M.R., MAUVAIS-JARVIS P., Les hormones gonadotropes de l'hypophyse humaine; structure et mecanisme d'action - Medecine de la reproduction. Ed Flammarion Medecine/Sciences (1986), 42-50
WORLD ANTI-DOPING AGENCY., The 2006 Prohibited List.
