DETECTIA CORTICOSTEROIZILOR PRIN LC/MS/MS

Georgeta BICAN

Valentin POP

 Graziela VAJIALA

Mia LAMOR

Agentia Nationala Anti-Doping

Cuvinte cheie: corticosteroid, LCMS

Keywords: corticosteroid, LCMS

Rezumat

Glucocorticosteroizii sunt agenti antiinflamatori, descresc durerea si cresc abilitatea atletului de a se concentra in competitiile de forta sau de rezistenta. Pentru a preveni abuzul acestora, in special in tratarea durerilor, glucocorticosteroizii au fost introdusi pe lista de substante interzise in competitie.

Lucrarea descrie o metoda screening simpla si sensibila pentru 17 corticosteroizi prin cromatografie de lichid cuplata cu spectrometria de masa in tandem cu triplu quadrupol. Metoda poate detecta corticosteroizii din probele de control doping pana la o concentratie de 20ng/ml, sub nivelul de performanta minim cerut de Agentia Mondiala Anti-Doping, care este 30ng/ml.

Introducere

Corticosteroizii sunt o clasa de substante medicamentoase utilizata uneori in mod abuziv de catre sportivi. Corticosteroizii sunt substante foarte active in tratamentul inflamatiilor si astmului [3]. Corticosteroizii pot avea efect asupra sistemului nervos si pot ameliora capacitatea de concentrare a sportivilor in probele de forta sau de rezistenta [1,5]. In plus, corticosteroizii pot diminua durerile.

Pentru a preveni utilizarea abuziva, in special in vederea efectului euforic sau de suprimare a durerilor, organismele anti-doping restrictioneaza utilizarea corticosteroizilor. Utilizarea sistemica a corticosteroizilor este interzisa in orice circumstante insa, daca este necesar din punct de vedere medical, injectiile locale si intra-articulare sau preparatele dermatologice sunt permise, cu conditia obtinerii unei scutiri pentru uz terapeutic [6].

Detectia corticosteroizilor prin tehnica cromatografiei de gaze cuplata cu spectrometria de masa, GC/MS, nu reprezinta cea mai buna solutie. Desi asemanatori ca structura cu steroizii, numarul mai mare de functiuni polare din molecula unui corticosteroid provoaca o volatilitate sensibil mai scazuta decat a acestora, derivatizarea completa a functiunilor polare este mai dificil de realizat, iar compusul total derivatizat are o masa moleculara sensibil mai mare.

Dotarea Laboratorului de Control Doping cu un echipament performant, cromatograf de lichide de inalta presiune cuplat cu un spectrometru de masa in tandem, cu triplu quadrupol, LC/MS/MS Varian 1200L, a permis specialistilor utilizarea unei tehnici analitice de inalta sensibilitate si selectivitate, ideala pentru analiza coricosteroizilor. In figura 1 sunt prezentate structurile chimice pentru doi compusi reprezentativi din aceasta categorie de substante interzise.

Figura 1. Structura chimica a corticosteroizilor

Materiale si metode

Metoda a fost dezvoltata pe solutii etalon de corticosteroizi in concentratie de 10ppm. Standardele au fost procurate de la Sigma-Aldrich, beta-glucuronidaza din E. Coli K12 de la Roche Diagnostics, Germania, iar apa ultrapura a fost obtinuta utilizand sistemul de fitrare Simplicity 185, Millipore, Marea Britanie.

Prelucrare probe. Probele au fost prelucrate utilizand metoda de extractie combinata [4,6] a compusilor din clasa steroizilor anabolici androgeni si corticosteroizilor.

Parametrii analitici. Analiza a fost efectuata pe echipamentul sus-mentionat, folosind o coloana OmniSpher 3 C18 (100 x 2.0mm diam.int., dimens.part. 3m).

Conditii LC: faza mobila, A=metanol%,B=5Mm acetat de amoniu si 0,1% acid acetic in apa ultrapura Millipore; debit 0,25ml/min, gradient A: 70% timp de 3min, 70%50% in 16min, 50%30% in 1min si 5min reechilibrare 70%, volum injectie 10l.

Conditii MS: APCI 50⁰C, mod de ionizare negativ si monitorizarea reactiilor multiple (MRM), timp de scanare 1s, presiune Ar in celula de coliziune 1,50mTorr.

Rezultate si discutii

Stabilirea parametrilor MS ai fiecarei substante s-a realizat utilizand solutii de concentratie 10ppm, solutii preparate in amestec 80% metanol si 20% tampon B. Solutiile respective au fost injectate direct prin interfata APCI in spectrometrul de masa. Intai s-a stabilit ionul parinte din parent scan si s-a optimizat voltajul pe capilar pentru o cat mai ridicata abundenta. Apoi, s-au obtinut tranzitiile MS/MS la energiile de coliziune respective prin utilizarea procedurii automate de MS/MS breakdown pusa la dispozitie de sistemul Varian 1200L.

In analiza screening s-a stabilit monitorizarea a cate doua tranzitii parinte/fiica[2]. Doar pentru cortizon si hidrocortizon, corticosteroizi endogeni, s-a ales doar o tranzitie MS/MS reprezentativa.

In tabelul nr. 1 sunt prezentate substantele analizate, timpii de retentie corespunzatori, tranzitiile specifice la energiile de coliziune stabilite pentru fiecare precursor>produs in parte.

In figura 2 este prezentata cromatograma LC/MS/MS a unui amestec de standarde.

Tabel nr. 1. Parametrii analitici ai corticosteroizlor in analiza screening prin LC/MS/MS.

Nr. crt. Compus Masa moleculara Tranzitie (precursor>produs, energie coliziune, eV) Timp de retentie, min 1 Triamcinolon 394 (-)453.2>345 +23;(-)453.2>363 +12 5,5 2 Prednison 358 (-)417.2>327 +18;(-)417.2>357 +8 7,3 3 Cortizon 360 (-)419.2>329 +16 7,6 4 Prednisolon 360 (-)419.2>329 +16;(-)419.2>295 +36.5 8,7 5 Hidrocortizon 362 (-)421.2>331 +19 8,7 6 Flumetazon 410 (-)469.2>379 +19;(-)469.2>305 +41 10,4 7 Betametazon + Dexametazon 392 (-)451.2>361 +19;(-)451.2>307 +33 10,8 8 Triamcinolon acetonid 434 (-)493.2>375 +14;(-)493.2>413 +22 11,1 9 Fludrocortison acetat 422 (-)481.2>349 +25.5;(-)481.2>341 +21 11,1 10 Metilprednisolon 374 (-)433.2>343 +17.5;(-)433.2>309 +37 11,2 11 Beclometazon 408 (-)467.2>377 +14;(-)467.2>341 +21.5 11,3 12 Flunisolid 434 (-)493.2>375 +14;(-)493.2>357 +21 11,8 13 Fluorometolon 376 (-)435.2>59 +12;(-)435.2>355 +16 12,0 14 Flurandrenolid 436 (-)495.2>377 +14;(-)495.2>359 +20 12,1 15 SI-Desoximetason 376 (-)435.2>355 +16 12,6 16 Fluocinolon acetonid acetat 494 (-)553.2>375 +18;(-)553.2>355 +24 15,5 17 Budesonid 430 (-)489.2>357 +13.5;(-)489.2>339 +19 15,6 18 Fluticazon propionat 500 (-)559.2>413 +22.5;(-)559.2>433 +15.5 17,9

Una din tranzitiile caracteristice ale prednisolonului coincide cu o tranzitie a cortizonului, dar cei doi compusi sunt bine separati cromatografic. De asemenea, fluorometolonul si standardul intern, desoximetazona au eceleasi tranzitii parinte>fiica, dar picurile cromatografice sunt bine separate, astfel fluorometolonul se obtine la minutul 12 in timp ce SI: Desoximetazona la minutul 12,6 cu o separare cromatografica de 60 sec. Triamcinolon acetonidul are doua tranzitii comune cu flunisolidul, dar tranzitia (-)493.2>413 +22 este caracteristica pentru triamcinonid. De asemenea, triamcinolon acetonidul si flunisolidul sunt bine separati cromatografic asa cum se observa din tabelul nr. 1 si figura 2.

Figura 2. Analiza unui blanc de urina spikat cu 20ng/ml corticosteroizi

Pentru confirmarea unei probe pozitive sunt monitorizate cel putin 3 tranzitii specifice pentru ficare substanta de analizat. Astfel, pentru dexametazona, dupa studierea spectrului de masa obtinut in urma disocierii moleculare a ionului parinte in celula de coliziune, tranzitiile selectate sunt: (-)451.2>361 +19; (-)451.2>307 +33; (-)451.2>325 +35; (-)451.2>292 +41.

Concluzii

Tehnica LC/MS/MS descrisa este simpla si sensibila, cromatograful de lichide cuplat cu un spectrometru de masa in tandem cu triplu quadrupol dovedindu-se un instrument eficace pentru laboratorul de control doping.

Selectivitatea monitorizarii reactiilor multiple si folosirea unei coloane HPLC eficiente, permite detectarea simultana a 17 glucocorticosteroizi intr-o singura analiza.

Monitorizarea simultana a mai multor tranzitii pentru acelasi compus, permite confirmarea indubitabila a prezentei corticosteroizilor detectati in screening.

Abstract

Glucocorticosteroid drugs are synthetic analogues of hormones which are anti-inflammatory agents, alleviate pain and enhance athlete's ability for concentration during strength and endurance competitions. A simple and sensitive LC/MS/MS method is described below for the screening of 17 corticosteroids. The method is able to detect corticosteroids from the doping control urine samples at 20ng/mL – below the WADA minimum required performance level (MRPL), which is 30ng/mL.

Bibliografie

CUMMISKEY, J., Glucocorticosteroids in Doping in Sport, Concerted Action in the Fight Against Doping in Sport (CAF-DIS), Dublin, 2002

DEVENTER, K.; DELBEKE, F.T., Validation of a screening method for corticosteroids in doping analysis by liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003; 17: 2107-2114.

HARDMANN, J. G.; LIMBIRD, E. J., The Pharmacological Basis of Therapeutics (9^th edn.). New Zork, 1996.

MARECK, U.; THEVIS, M.; GUDDAT, S.; GOTZMANN, A.; BREDEHOFT, M.; GEYER, H.; SCHANZER, W., Comprehensive sample preparation for anabolic steroids, glucocorticosteroids, beta-receptor blocking agents, selected anabolic androgenic steroids and buprenorphine in human urine, Recent Advances in Doping Analyses (12), Sport und Buch Strauss, Koln (2004), 65-68.

POLETTINI, A.; MARRUBINI BOULAND, G.; MONTAGNA, M. J., J. Chromatogr. B 1998; 713:339.

P0P, V.; VAJIALA, G.; LAMOR, M.; BICAN, G.; TONE, M., Comparative analytical techniques for the identification of some androgenic anabolic steroids (GC/MS – LC/MS/MS), Recent Advances in Doping Analyses (13), Sport und Buch Strauss, Koln (2005), 369-374.

WADA 2006 Prohibited List – International standard.