EXCRETIA RENALA SI DETECTIA METABOLITILOR BOLDIONULUI

Mirela ZORIO

Ileana VAJIALA

 Mia LAMOR

Rodica PICU

Agentia Nationala Anti-Doping

Cuvinte cheie: Boldion, Boldenon, Equi-Bolan

Keywords: Boldione, Boldenone, Equi-Bolan

Rezumat

Pe langa studiile efectuate in ultimii ani privind contaminarea cu substante interzise a suplimentelor nutritionale destinate sportivilor, comercializate pe piata romaneasca, Laboratorul de Control Doping este preocupat de analiza efectelor unor preparate din generatia mai noua de suplimente, accesibile pe Internet, asupra pozitivarii testelor de control doping.

Lucrarea prezinta identificarea metabolitilor prezenti in urina dupa administrarea preparatului Equi-Bolan, continand Boldion (1,4–androstadien–3,17–diona), substanta aflata pe Lista Substantelor Interzise de Agentia Mondiala Anti-Doping (AMAD). Screening-ul de rutina pentru analiza steroizilor anabolici androgeni poate fi astfel completat, in vederea detectiei Boldionului.

Introducere

In ultimii ani, Laboratorul de Control Doping a efectuat studii privind contaminarea cu substante interzise a suplimentelor nutritionale destinate sportivilor, comercializate pe piata romaneasca. In lucrarile publicate [1,6] s-au prezentat rezultatele analizelor efectuate prin cromatografie de gaze/spectrometrie de masa (GC/MS) pentru compusii steroidici de tipul prohormonilor Nandrolonului, Testosteronului si Dihidrotestosteronului (DHT). Din generatia mai noua de suplimente, usor de obtinut de pe Internet (fig.1), face parte si 1,4-androstadien-3,17-diona (Boldion), destinat transformarii endogene in Boldenon (1,4-androstadien-17beta-ol-3-ona), steroid anabolic androgen. Atat compusul steroidic cat si precursorul sau se afla pe Lista substantelor interzise, elaborata de AMAD [2].

Figura 1 Preparate continand Boldion

Dupa cum se observa din structura chimica (fig.2), Boldionul este „diona„ Boldenonului, fiind activat in organism de catre enzima 17beta-hidroxisteroid- dehidrogenaza, care converteste androstendiona in testosteron.

Figura 2. Metabolismul Boldenonului si Boldionului

Administrarea orala de 1,4-androstadien-3,17-diona, sub forma preparatului Equi-Bolan [6], produce profilul clasic al excretiei Boldenonului [5], respectiv metabolitii redusi in pozitia 5beta- se elimina sub forma de glucuronati: 5beta-androst-1-en-3alfa-ol-17-ona (majoritar); 5beta-androst-1-en-17beta-ol-3-ona; 5beta-androst-1-en-3alfa-17beta-diol si 5beta-androst-1-en-3,17-diona (fig.2).

Lucrarea prezinta un studiu de excretie pentru identificarea metabolitilor caracteristici ai Boldionului si Boldenonului in vederea detectiei abuzului acestora in procedurile screening pentru steroizi anabolici androgeni.

Materiale si metode

1. Standarde si produse farmaceutice:

Boldion, Boldenon si metabolitul (5beta-androst-1-en-17beta-ol-3-ona) au fost procurate de la Laboratorul Control Doping din Köln iar preparatul Equi-Bolan a fost procurat de pe Internet.

2. Studiu de excretie

S-a administrat o singura pastila de Equi-Bolan de 50mg, unui voluntar de sex masculin (33 ani). Probele de urina au fost recoltate la 12, 24 si 36 de ore dupa administrare. Inainte de administrare, s-a recoltat subiectului o proba de urina (urina blanc). Probele au fost conservate prin congelare si inainte de analiza li s-a luat densitatea si pH-ul.

3. Prepararea probelor

Extractia s-a realizat din 2 mL de urina conform procedurii aplicate pentru screening-ul steroizilor anabolici androgeni, prin analiza fractiei combiante cu exctractie lichid-lichid si hidroliza enzimatica (beta- glucuronidaza din E.Coli), urmata de extractia cu tert-butil-metil-eter si derivatizarea cu amestec de MSTFA/NH₄I/Etantiol [5]. Derivatii trimetilsililati obtinuti s-au analizat prin metoda cromatografiei de gaze cuplata cu spectrometria de masa (GC/MS) in modul SCAN si SIM. S-a folosit un sistem Agilent GC 6890N/MS 5973 Network, coloana ULTRA 1, 17m lungime, 0,25 mm, 0,12microm. Probele au fost analizate in paralel cu proba de urina negativa a subiectului si cu o proba de referinta continand Boldenon, Boldion si 5beta-androst-1-en-17beta-ol-3-ona in concentratie de 100ng/ml. In toate probele s-a adaugat standard intern de Metiltestosteron.

Rezultate si discutii

Identificarea metabolitilor dupa administrarea Boldionului s-a realizat prin compararea timpilor de retentie si a spectrelor de masa obtinute in modul SCAN intre probele recoltate si proba de referinta. In fig.3 este prezentata cromatograma totala de ioni si spectrul SCAN pentru metabolitul majoritar corespunzator probei prelevate la 36 ore de la administrare. In toate cele trei probe recoltate se observa un semnal intens la T_R = 14,13 (picul 1) prezentand in spectrul SCAN fragmentele de masa caracteristice m/z: 290, 275, 194. In spectru sunt prezenti si ionii m/z: 434, 419 corespunzatori Androsteronului, care elueaza la acelasi timp de retentie. Comparand cu datele de literatura [3,4] semnalul corespunzator metabolitului 5beta-androst-1-en-3alfa-ol-17-ona (picul 1) este coelutiv cu Androsteronul. Prin comparare cu proba blanc si cu cea de referinta, in probele de excretie se mai observa semnale la T_R = 13,10 (m/z: 194, 432, 206) – picul 2, T_R = 15,91 (m/z: 206, 430, 325) – picul 3 si la T_R = 15,66 (m/z: 428, 413, 323) – picul 4. Comparand cu spectrele si timpii de retentie din proba de referinta, semnalele corespund metabolitului boldenonului -5beta-androst-1-en-17beta-ol-3-ona (picul 2), Boldenonului (picul 3) si Boldionului (picul 4). In tabelul nr.1 este prezentat raportul metabolitilor si compusilor identificati in cele trei probe recoltate dupa administrarea de Equi-bolan, fata de metabolitul majoritar.

Tabelul nr.1 Raportul compusilor identificati dupa administrarea Boldionului fata de metabolitul majoritar al acestuia.

Boldenonul excretat in primele 12 ore de la administrare indica conversia endogena a Boldionului in acest steroid. Analiza probei prelevata la 36 de ore dupa administrare, indica o cantitate foarte mica de Boldenon si Boldion, sugerand metabolizarea intensa a acestora.

Figura 3. Cromatograma totala de ioni si spectrul scan al metabolitului majoritar corespunzator probei prelevata la 36 de ore de la administrare.

Concluzii

Prin administrarea Boldionului s-a obtinut compusul nemodificat, precum si Boldenonul, ceea ce indica o conversie intre acesti compusi.

Ca urmare a identificarii timpilor de retentie si a fragmentelor caracteristice, criteriile de detectie in testarea de rutina pentru Boldenon pot fi aplicate si pentru 1,4–androstadien–3,17–diona (Boldion).

Analiza screening aplicata probelor de urina pentru detectia steroizilor anabolici androgeni (screening 4) poate fi extinsa in achizitia SIM permitand raportarea rezultatelor pentru Boldion.

Abstract

Beside the studies developed in the last years regarding the contamination with prohibited substances of nutritional supplements intended for athletes, commercialized on the Romanian market, the Doping Control Laboratory is focused on analyzing the effects of same products belonging to a new generation of supplements, available on Internet, over the obtaining of adverse analytic findings in doping control tests. The paper presents the identification of metabolites available in urine after the administration of Equi-Bolan product containing Boldione (1,4–androstadien–3,17–dione), a prohibited substance included on WADA^'s Prohibited List. Therefore, the routine screening for anabolic androgenic steroids' analysis may be completed, in order to detect Boldione.

Bibliografie

Lamor, M.; Vajiala, I.; Vajiala, G., "The Quantification of Prohormones in Nutritional Supplements". Recent Advances in Doping Analysis (12), Köln, Ed. Sport und Buch Straubeta, 2004, pag.497-501.

*** Lista substantelor interzise pe anul 2006 Agentia Mondiala Antidoping.

Schanzer, W., Donike, M., "Metabolism of Boldenon in Man: Gas Chromatographic/Mass Spectrometric Identification of Urinary Excreted Metabolites and Determination of Excretion Rates". Biol Mass Spectrom 1992; vol.21,pag.3-16.

Uralets, V.P., Gillette, P.A, " New Anabolic Steroids Available as Nutritional Supplements: 5alfa-Androstan-3beta,17beta-diol, 1,4–Androstadien–3,17–dione and 5alfa-Androst-1-en-17beta-ol-3-one". Recent Advances in Doping Analysis (10), Köln, Ed., Sport & Buch Straubeta, 2002, pag.73-82.

Vajiala, G., Lamor, M., Chitimia, B., "Benzbromarone, a Possible Masking Agent of Anabolic Androgenic Steroids". Recent Advances in Doping Analysis (9), Köln, Ed. Sport und Buch Straubeta, 2001, pag.233-238

Vajiala, G., Lamor, M., Subasu, R., "The Tracing out of the Contamination with Doping Agents of the Nutritional Supplements". Recent Advances in Doping Analysis (10), Köln, Ed. Sport und Buch Straubeta, 2002, pag.267-271.