OPTIMIZAREA PARAMETRILOR DE DETECTIE AI SUBSTANTELOR INTERZISE CU ECHIPAMENTUL LC/MS/MS AGILENT 6410

Valentin POP

Georgeta BICAN

Mia LAMOR

Agentia Nationala Anti-Doping

Cuvinte cheie: doping, substante interzise, LCMS

Key words: doping, prohibited substances, LCMS

Rezumat

Lucrarea descrie optimizarea parametrilor de detectie LC/MS/MS pentru sase substante interzise de catre organismele antidoping: buprenorfina, dutasterid, carboxi-finasterid (metabolit al finasteridului), bis(4-cianofenil)-metanol (metabolit al letrozolului), raloxifen si toremifen. Optimizarea este realizata simultan pentru toti cei sase compusi cu ajutorul unui amestec care contine fiecare compus in concentratie de 1ppm. Echipament folosit: LC/MS/MS cu triplu quadrupol Agilent 6410.

Introducere

Cromatografia de lichid cuplata cu spectrometria de masa este utilizata tot mai des in laboratoarele de control doping deoarece analiza necesita o procedura mai simpla de prelucrare a probei biologice si deasemenea, pot fi analizati o serie intreaga de compusi pentru care alte tehnici de analiza sunt improprii.

Dotarea Laboratorului de Control Doping cu un echipament performant, cromatograf de lichide de inalta presiune cuplat cu un spectrometru de masa in tandem, cu triplu quadrupol, LC/MS/MS Agilent 6410, a permis specialistilor utilizarea unei tehnici analitice de inalta sensibilitate si selectivitate, ideala pentru analiza substantelor respective.

In lucrarea de fata este prezentata optimizarea parametrilor de detectie pentru urmatoarele substante: buprenorfina, toremifen, raloxifen, carboxi-finasterid, dutasterid, bis(4-cianofenil)-metanol. Buprenorfina este un agent narcotic, toremifenul si raloxifenul sunt agenti anti-estrogenici, bis(4-cianofenil)-metanolul este metabolitul principal al letrozolului, un inibitor de aromataza, iar finasteridul si dutasteridul sunt inhibitori de alfa-reductaza [WADA, 2007]. Toate aceste substante pot actiona, prin diverse mecanisme, in vederea cresterii artificiale a performantei sportive sau a mascarii folosirii altor agenti dopanti. De asemenea, datorita unei mase moleculare mari sau a unei structuri chimice cu multe functiuni polare, sunt greu sau imposibil de depistat prin metodele GCMS clasice [Hardmann, 1996; Koen D., 2006, pag. 1]. In figura 1 sunt prezentate structurile chimice ai celor sase compusi.

Figura 1 - Structura chimica a compusilor

Materiale si metode

Metoda a fost dezvoltata pe un amestec de solutii etalon de dutasterid, buprenorfina, toremifen, raloxifen, carboxi-finasterid (metabolitul finasteridului), bis(4-cianofenil) metanol (metabolitul letrozolului) in concentratie de 1ppm in metanol. Materialele de referinta au fost procurate de la Sigma-Aldrich, AK Scientific, Promochem, National Measurement Institute – Australian Government, beta-glucuronidaza din E. Coli K12 de la Roche Diagnostics, Germania, iar apa ultrapura a fost obtinuta utilizand sistemul de fitrare Simplicity 185, Millipore, U.K..

Prelucrare probe. Probele au fost prelucrate utilizind metoda de extractie combinata [Mareck, U., 2004, pag. 65; Pop, V., 2005, pag. 369] a compusilor din clasa steroizilor anabolici androgeni si corticosteroizilor.

Parametrii analitici. Analiza a fost efectuata pe echipamentul LC/MS/MS AGILENT 6410, folosind o coloana ZORBAX SB-C18 (2,1 x 50mm, dimens.part. 5m).

Conditii LC: faza mobila, A= 5mM NH₄HCOO in apa ultrapura Millipore, B=5mM NH₄HCOO in acetonitril; debit 0,3ml/min, gradient A: 70% timp de 1min, 70%50% in 3min, 50%70% in 5min si 5min reechilibrare 70%, volum injectie 1l.

Conditii MS: interfata de ionizare ESI, mod de ionizare pozitiv, moduri de scanare utilizate MS2SCAN, MS2SIM, Product Ion, monitorizarea reactiilor multiple (MRM).

Rezultate si discutii

Stabilirea parametrilor MS ai fiecarei substante s-a realizat utilizand un amestec de solutii de concentratie 1ppm. Amestecul respectiv a fost injectat in modul de scanare MS2SCAN si s-a stabilit ionul precursor pentru fiecare compus in parte. Optimizarea energiei de fragmentare a ionului molecular la ionul precursor s-a realizat in modul de scanare MS2SIM pentru o cat mai ridicata abundenta. Apoi, s-a trecut la obtinerea tranzitiilor Precursor Ion la Product Ion. Dupa alegerea tranzitiilor specifice fiecarui compus s-au optimizat energiile de coliziune si s-a stabilit metoda finala de monitorizare a reactiilor multiple. In analiza screening s-a stabilit monitorizarea a cate doua tranzitii parinte/fiica.

In tabelul nr. 1 sunt prezentate substantele analizate, timpii de retentie corespunzatori, tranzitiile specifice la energiile de coliziune stabilite pentru fiecare precursor>produs in parte, iar in figura 2 este prezentata cromatograma LC/MS/MS a unui amestec de standarde.

Compus Masa mol. Tranzitie (precursor>produs, energie coliziune,eV) Timp de retentie, min Carboxi-finasterid (metabolitul finasteridului), 402 (+)403>272 -30; (+)403>335 -30 2,06 Bis(4-cianofenil)-metanol (metabolitul letrozolului) 234 (+)217>163 -40; (+)217>190 -20 3,46 Raloxifen 473 (+)474>84 -50; (+)474>112 -30 3,87 Buprenorfina 467 (+)468>55 -50; (+)468>396 -40 4,55 SI-Metiltestosteron 302 (+)303>109 -20 5,53 Toremifen 405 (+)406>72 -30; (+)406>205 -30 7,79 Dutasterid 528 (+)529>95 -50; (+)529>461 -40 8,23

Tabel nr. 1 - Parametrii analitici ai compusilor studiati in analiza screening prin LC/MS/MS.

Compusii analizati formeaza ioni precursori prin protonare, [M+H]⁺. Metabolitul letrozolului, bis(4-cianofenil metanol) formeaza ionul precursor prin ionizarea cu un H⁺ si pierderea unei molecule de apa, [M+H-H₂O]⁺.

Pentru confirmarea unei probe pozitive sunt monitorizate cel putin 3 tranzitii specifice pentru fiecare substanta de analizat. Astfel, pentru toremifen, dupa studierea spectrului de masa obtinut in urma disocierii moleculare a ionului parinte in celula de coliziune, tranzitiile selectate sunt: (+)406>72 -30; (+)406>205 -30; (+)406>70 -50.

Concluzii

Tehnica LC/MS/MS descrisa este simpla si sensibila, cromatograful de lichide cuplat cu un spectrometru de masa in tandem cu triplu quadrupol dovedindu-se un instrument eficace pentru efectuarea analizelor de control doping.

Selectivitatea monitorizarii reactiilor multiple si folosirea unei coloane HPLC eficiente, permite detectarea simultana a compusilor respectivi intr-o singura analiza.

Monitorizarea simultana a mai multor tranzitii pentru acelasi compus, permite confirmarea indubitabila a prezentei substantei respective.

Figura 2 - Cromatograma totala de ioni (TIC) si tranzitiile MRM ale compusilor de interes extrase din cromatograma LC/MS/MS a amestecului de standarde (la t_R 5,531 se afla picul SI-Metiltestosteronului).

Abstract

The present paper describes the optimization of the LC/MS/MS detection parameters for six prohibited substances from the WADA List: buprenorphine, dutasteride, carboxy-finasteride (finasteride metabolite), bis(4-cyanophenyl)-methanol (letrozole metabolite), raloxifene and toremifene. The optimization is simultaneously achieved for all six compounds, using a mixture containing each compound in a concentration of 1ppm. Equipment used: triple quadrupole LC/MS/MS Agilent 6410.

Bibliografie

HARDMANN, J. G.; LIMBIRD, E. J., The Pharmacological Basis of Therapeutics (9^th edn.). New York, 1996

KOEN D., Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, an evolution in doping analysis, Nautilus Academic Books, 2006

MARECK, U.; et al., Comprehensive sample preparation for anabolic steroids, glucocorticosteroids, beta-receptor blocking agents, selected anabolic androgenic steroids and buprenorphine in human urine, Recent Advances in Doping Analyses (12), Sport und Buch Strauss, Koln, 2004

P0P, V.; VAJIALA, G.; LAMOR, M.; BICAN, G.; TONE, M., Comparative analytical techniques for the identification of some androgenic anabolic steroids (GC/MS – LC/MS/MS), Recent Advances in Doping Analyses (13), Sport und Buch Strauss, Koln (2005)

*** WADA 2007 Prohibited List – International standard.