 |
 |
 |
 |
IDENTIFICAREA EFEDRINELOR PRIN CROMATOGRAFIE DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA CU DETECTIE UV-VIS
Ruxandra SUBASU
Ileana VAJIALA
Andreia TACHE
Agentia Nationala Anti-Doping
Cuvinte cheie: Efedrine, HPLC
Keywords: Ephedrines, HPLC
Rezumat
Pe langa efectele terapeutice in gripe si alergii, Efedrina si congenerii ei - Pseudoefedrina, Norefedrina, Norpseudoefedrina si Metilefedrina - sunt stimulente ale sistemului nervos central, fiind astfel stabilite limite permise ale prezentei lor in urina sportivilor. Pentru detectia simpla, rapida si selectiva a efedrinelor prin tehnica cromatografiei de lichide de inalta performanta HPLC, s-au comparat parametrii cromatografici, cum ar fi coloane de faza reversa, compozitia si pH-ul fazei mobile, debitul efluentului pe coloana, in scopul optimizarii acestei metode analitice.
Introducere
Efedrina-Pseudoefedrina si Norefedrina-Norpseudoefedrina (Catina) sunt perechi de compusi diastereoizomeri care, alaturi de Metilefedrina, sunt inclusi pe Lista substantelor interzise elaborata de Agentia Mondiala Anti-Doping (AMAD) in clasa stimulentelor [WADA, 2007]. Deoarece sunt folosite pe scara larga in preparatele farmaceutice care trateaza astmul, afectiunile oculare, raceala si alergiile, prin documentele tehnice elaborate de AMAD [WADA, 2007] s-au stabilit valori ale concentratiilor in urina de la care probele pot fi considerate pozitive din punct de vedere al controlului doping - 5μg/mL Catina, 10μg/mL Efedrina si Metilefedrina.
Identificarea efedrinelor in urina este dificila pentru ca prezinta structuri chimice similare (fig. 1) si sunt compusi bazici cu grupe functionale polare. Separarea lor prin tehnica cromatografiei de gaze cuplata cu spectormetria de masa GC/MS necesita etapa de derivatizare selectiva dar reproductibilitatea obtinuta nu este satisfacatoare pentru ca se pot obtine mai multi derivati ai aceluiasi compus [Thevis, M.; et al., 2003, pag. 303].
Au fost publicate mai multe metode de separare a efedrinelor din urina prin cromatografie de lichide de inalta performanta, pe coloane de faza reversa, fara derivatizare, dar in conditii cromatografice diferite [Imaz, C., et al., 1993, pag. 201; Van der Merwe, P., et al., 1994, pag. 357; Imaz, C., et al., 2000, pag. 23]. Scopul acestei lucrari a fost de a compara eficienta separarii pe diferite coloane de faza reversa, cu diferite faze mobile si debite, in vederea optimizarii conditiilor cromatografice de determinare a efedrinelor in Laboratorul de Control Doping.
 |
Materiale si metode
Materiale: Substantele de referinta pentru efedrine au fost procurate de la LGC Promochem Franta. Toti ceilalti reactivi si solventi folositi sunt de puritate analitica si cromatografica si provin de la Sigma si Merck. Pentru dezvoltarea metodei s-a folosit un amestec in metanol de Efedrina, Pseudoefedrina, Catina, Metilefedrina si Norefedrina, in concentratie de 5μg/mL.
Analiza HPLC: Analiza instrumentala s-a efectuat pe un cromatograf de lichide de inalta performanta HPLC Agilent seria 1100, prevazut cu pompa cuaternara si injector automat. Efluentul coloanei a fost monitorizat cu un detector DAD UV-VIS, la lungimea de unda 214nm.
Metode: Pentru separarea cromatografica s-au folosit 2 coloane, si anume ODS Hypersil 4,6x150mm, 5μm si BDS-C18 Hypersil 4,6x150mm, 5μm. Incercarile s-au efectuat la temperatura ambianta, in modul isocratic, la debite ale fazei mobile de 1,5mL/min si 1,0mL/min, mentinute constante pe coloana in timpul analizei. Parametrii selectati pentru optimizare au fost variati in cadrul a trei metode diferite:
A: Faza mobila este constituita din tampon fosfat 50mM cu trietilamina la concentratia finala de 25mM. Tamponul s-a preparat din anumite volume de acid fosforic 50mM - trietilamina TEA 25mM adaugate la o solutie de fosfat biacid de potasiu 50mM - trietilamina TEA 25mM. S-a ajustat aciditatea la valori ale pH-ului de 2,6; 3,5; 4,5; 5,5 si 6,55. In toate cazurile debitul de 1,5 mL/min a fost mentinut constant pe coloana, iar incercarile s-au efectuat atat pe coloana ODS cat si pe BDS-C18.
B: Faza mobila o constituie amestecul de fosfat de tetraetilamoniu - metanol (98:2, v:v). Solutia tampon s-a preparat din 15,54 g hidroxid de tetraetilamoniu, 2,8g acid fosforic 89% si completare cu apa la volumul final de 500mL. PH-ul s-a ajustat la valori de 2,8; 5,5 si 4,15, in fiecare caz lucrandu-se la valori ale debitului de 1,0mL/min si 1,5mL/min, mentinute constante pe coloana in timpul analizei, pe ambele coloane cromatografice ODS si BDS.
C: Faza mobila constituita din fosfat de tetraetil amoniu 100% isocrat, tampon preparat ca la metoda B. S-a lucrat la valori ale pH-ului de 2,8, la debit de 1mL/min, pe ambele coloane cromatografice.
Rezultate si discutii
In fig. 2 si fig. 3 sunt prezentate cromatogramele amestecului de efedrine analizate conform metodei B, dar pe coloane diferite, avand aceeasi ordine de elutie cromatografica si anume: Norefedrina (Tr 4.44), Catina (Tr 5.44), Metilefedrina (Tr 7.26), Efedrina (Tr 8.52) si Pseudoefedrina (Tr 9.07). In cazul coloanei BDS (fig.2) picurile cromatografice sunt mai simetrice si mai bine separate, dar o separare mai buna a perechii critice Efedrina/Pseudoefedrina s-a obtinut pe coloana ODS (fig.3).
 |
 |
 |
In fig. 4 si fig. 5 sunt prezentate cromatogramele amestecului de efedrine, analizat prin metoda B, separate pe coloana BDS, la debite diferite. Se observa ca la debitul de 1,5mL/min perechea critica de Efedrina/Pseudoefedrina este mai bine separata (fig. 5). In fig. 6 este prezentata cromatograma aceluiasi amestec de efedrine analizat prin metoda C. Influenta compozitiei fazei mobile asupra separarii cromatografice rezulta din comparatia cu fig. 4. Absenta metanolului din eluent duce la aparitia picurilor foarte late atat pentru perechea critica Efedrina/Pseudoefedrina cat si pentru celelalte semnale analitice. Influenta pH-ului fazei mobile asupra separarii cromatografice se observa din fig. 7 si fig. 8 in care semnalele compusilor din amestecul analizat in conditiile metodei A, obtinute la un pH mai putin acid (fig. 8) sunt foarte slabe comparative cu cele obtinute la un pH puternic acid (fig. 7).
 |
 |
 |
 |
Concluzii
Separarea efedrinelor pe coloane de faza reversa duce la picuri late, asimetrice, datorita gruparilor acide prezente in faza stationara. Pentru a reduce acest efect este necesara o faza mobila de tarie ionica ridicata si modificatori pe baza de amine. Din studiul efectuat pana la momentul actual consideram ca cele mai bune rezultate pentru separarea simultana a efedrinelor prin cromatografie de lichide de inalta performanta cu detectie DAD UV-VIS se obtin utilizand o coloana cromatografica BDS cu faza mobila TEAH: metanol (98:2), la un pH de 2,8 si debit pe coloana 1,5 mL/min.
Abstract
In addition to therapeutical effects in colds and allergies, Ephedrine and its congeners - Pseudoephedrine, Norephedrine, Norpseudoephedrine and Methylephedrine - are all potential central nervous system stimulants and therefore permitted levels of their presence in urine samples have been established. For a simple, rapid and selective detection of ephedrines by HPLC technique, different chromatographic parameters, such as reversed-phase columns, mobile phase pH and composition, efluent flow-rate, were compared in order to optimize this analytical technique.
Bibliografie
IMAZ, C., et al., Determination of ephedrines in urine by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 631, 1993
IMAZ, C., et al., Comparison of various reversed-phase columns for the simultaneous determination of ephedrines in urine by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 870, 2000
THEVIS, M., et al., Confirmation of Ephedrines - Comparison between GC-MS and LC-MS/MS. Recent Advances in Doping Analysis (11), Koln, Ed. Sport und Buch Strau, 2003
VAN DER MERWE, P., et al., Simultaneous quantification of ephedrines in urine by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B 661, 1994
*** WADA, The World Anti-Doping Agency, http://www.wada-ama.org/
