IDENTIFICAREA SI CARACTERIZAREA PRIN TEHNICA GC/MS A FORMESTANULUI, TIBOLONULUI SI 19-NORCLOSTEBOLULUI

Mirela ZORIO

Rodica PICU

Mia LAMOR

Ileana VAJIALA

Agentia Nationala Anti-Doping

Cuvinte cheie: doping, substante interzise, GC/MS

Keywords: doping, prohibited substances, GC/MS

Rezumat

In aceasta lucrare s-a urmarit identificarea proprietatile analitice ale compusilor: formestan, 3alfa-hidroxi-tibolon (metabolit al tibolonului) si 19-norclostebol (metabolit al clostebolului) prin tehnica cromatografiei de gaze cuplata cu spectrometria de masa, substante aflate pe Lista Interzisa de catre Agentia Mondiala Anti-Doping (WADA, 2007), in sectiunea S1-Agenti anabolici si S4-Agenti cu activitate anti-estrogenica.

Identificarea compusilor s-a realizat prin determinarea parametrilor caracteristici (timp de retentie, timp relativ de retentie, spectru de masa) in probe de urina in care s-au adaugat materiale de referinta ale compusilor studiati.

Introducere

Avand in vedere ca pe Lista Interzisa elaborata de WADA se introduc anual noi compusi, o preocupare permanenta a cercetatorilor Laboratorului de Control Doping o constituie dezvoltarea de noi tehnici pentru detectarea acestora. Cercetatorii Laboratorului de Control Doping au realizat studii si cercetari pentru identificarea si caracterizarea unor noi substante interzise in sportul de performanta. Lucrarea prezinta identificarea unui agent cu activitate anti-estrogenica- formestan si a doi agenti anabolici - tibolon si clostebol, ale caror structuri chimice sunt prezentate in Figura 1.

Formestan Tibolon Clostebol

Figura 1 - Structurile chimice ale formestanului, tibolonului si clostebolului

Studii de literatura au relevat un efect anabolic crescut al acestor substante ceea ce a condus la introducerea lor pe Lista Interzisa la sectiunea S1 (tibolon si clostebol) si la sectiunea S4 (formestan) [WADA, 2007]. Formestanul face parte din grupa 4-hidroxi steroizilor si poate fi procurat de pe internet fiind promovat ca un preparat cu un inalt efect anabolic. Este un inhibitor de aromataza de 30 de ori mai puternic decat aminoglutetimidul [Parr, M.K., 2004, pag. 129)].

Tibolonul este un steroid sintetic cu proprietati estrogenice si androgenice, care se metabolizeaza rapid in 3alfa si 3beta-hidroxi-tibolon [Modelska, K., 2002, pag. 16].

Clostebolul este un steroid sintetic androgen cu efect anabolic, utilizat frecvent de catre sportivi pentru cresterea performantelor fizice. Metabolitii majoritari ai clostebolului, care se identifica in organism sunt: 4-clor-androst-4-en-3alfa-ol-17-ona (19-norclostebol) si 4-clor-androstan-3alfa-ol-17-ona [Debruyckere, G., 1992, pag. 1869].

In aceasta lucrare s-a urmarit identificarea proprietatile analitice ale formestanului, 3alfa-hidroxi-tibolon (metabolit al tibolonului) si 19-norclostebol (metabolit al clostebolului) prin tehnica cromatografiei de gaze cuplata cu spectrometria de masa.

Partea experimentala

Intr-o proba de urina negativa, procurata de la un subiect de sex masculin sanatos, care nu a consumat medicamente s-au adaugat cate 50ng/mL din standardele de formestan si 19-norclostebol, respectiv 200ng/mL din standardul de 3alfa- hidroxitibolon. Probele au fost prelucrate conform metodologiei de analiza screening pentru steroizi anabolici androgeni si analizate prin tehnica GC-MS in modul SCAN si SIM.

Materiale de referinta

Standardele de formestan (4-hidroxi-androstendiona) si 19-norclostebol (4-clor-19-nortestosteron) au fost procurate de la Steraloids, iar metabolitul tibolonului (3alfa-hidroxi tibolon) a fost procurat de la Laboratorul de Control Doping din Koln.

Prelucrare probe

Probele de urina la care s-au adaugat concentratii cunoscute ale substantelor de interes s-au prelucrat dupa metodologia de extractie lichid-lichid, hidroliza enzimatica (beta- glucuronidaza din E.Coli), urmata de extractie cu tert-butil-metil-eter si derivatizare cu amestec de MSTFA/NH₄I/Etantiol, pusa la punct in cadrul Laboratorului de Control Doping, Bucuresti [Vajiala, G., 2000, pag. 215] si acreditata in conformitate cu Standardul de Calitate SR EN ISO 17025:2005.

Parametrii GC/MS:

Coloana:  Ultra1 J&W Scientific cu umplutura 100% dimetil polixiloxan, lungime 17m, diametru intern 200microm, grosime film 0,11microm;

Gaz purtator:  Heliu 0,8ml/min, injectie split 1:10;

Temperatura injector: 300C;

Program temperatura: 160C (2min.), 5C/min - 255C, 30C/min - 285C(5min), 60C/min - 300C (2min);

Achizitie MS:

Volum injectie: 3microl ; rata spitarii 1:10;

Dwell time:  15 – 50msec.

Rezultate si discutii

Pe baza analizei screening in modul SCAN si achizitionarea cromatogramei totale de ioni, s-au stabilit parametrii caracteristici pentru identificarea formestanului, tibolonului si 19-norclostebolului, care sunt: timpul de retentie (t_R), timpul de retentie relativ (t_RR) si fragmentele de masa caracteristice. In tabelul 1 se prezinta parametrii caracteristici pentru substantele studiate.

Compus Timp de retentie (tR) (min) Timp de retentie relativ (tRR) m/z Formestan 18.47 1.069 518, 147, 503 Tibolon 15.07 0.921 443, 353, 209 19-norclostebol 18.61 1.078 452, 454, 437

Tabel 1 - Parametrii caracteriatici GC/MS pentru formestan, tibolon, 19-norclostebol

Din spectrul de masa al fiecarui compus studiat s-au selectat cate 3 fragmente de ioni caracteristice, intre care un fragment ionic cu abundenta cea mai mare in spectru (m/z: 518, 443 si 452) considerata 100%, fata de care se calculeaza abundentele relative ale celorlalte fragmente ionice. In conformitate cu Standardul International pentru Laboratoare, ca o proba de control doping sa fie pozitiva pentru unul dintre cei trei compusi studiati in lucrarea de fata, trebuie indeplinite urmatoarele criterii [WADA, 2004]:

Abundenta relativa (% din picul de baza) GC/MS >50% ±10% (absolut) 25%-50% ±20% (relativ) <25% ±5% (absolut)

Tabel 2 - Interval de toleranta maxima pentru intensitati relative de ioni

Dupa stabilirea timpilor de retentie si alegerea fragmentelor de masa caracteristice s-au efectuat prelucrari in modul SIM (selected ion monitoring), selectand ferestrele de timp in jurul timpilor de retentie ai compusilor studiati, realizand astfel o crestere a sensibilitatii analizei. In Figurile 2, 3 si 4 sunt prezentate cromatogramele de ioni si spectrele de masa TMS pentru cei trei compusi analizati.

Concluzii

S-au determinat parametrii caracteristici pentru identificarea prin tehnica GC/MS a substantelor interzise: formestan, tibolon si clostebol;

Rezultatele cerectarii au condus la elaborarea metodologiei de screening si confirmare pentru compusii studiati;

Prin introducerea formestanului, tibolonului si clostebolului in procedurile specifice ale Laboratorului de Control Doping s-a realizat eficientizarea controlului doping efectuat sportivilor romani, contribuind la participarea acestora la competitii nationale si internationale in conditii de fair-play.

Abstract

The present paper aimed to identify the analytic properties of two compounds from the WADA Prohibited List 2007 Section S1-Anabolic agents and Section S4-Agents with anti-estrogenic activity, formestan-3alfa-hidroxi-tibolon (tibolone metabolite) and 19-norclostebol (clostebol metabolite), by the technique of the gas-cromatography coupled with mass-spectrometry.

The compounds' identification has been achieved by measuring the characteristic parameters (retention time, relative retention time and mass-spectrum) in urine samples spiked with reference materials.

Figura 2 - Cromatograma totala de ioni si spectrul de masa pentru formestan

Figura 3 - Cromatograma totala de ioni si spectrul de masa pentru 3alfa-hidroxi tibolon

Figura 4 - Cromatograma totala de ioni si spectrul de masa pentru 19-norclostebol

Bibliografie

DEBRUYCKERE, G., et. al., Clostebol-positive urine after consumption of contaminated meat. In Clinical Chemistry, vol.38, nr.9, 1992

MODELSKA, K:, CUMMINGS, S., Tibolone for postmenopausal women: systematic rewiew of randomized trials. In The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism, 87(1), 2002

PARR, M.K., et. al. Analytical properties of 4-Hydroxysteroids and some esters. In: Donike, M., et. al. (eds.), Proceedings-12^th Cologne Workshop on Dope Analysis, Sport und Buch Strauß, Köln (2004)

VAJIALA, G., MIHAILESCU, R., LAMOR, M., Benzbromarone- a possible masking agent of androgen anabolic steroids; Identification by GC/MS and its Action upon the Steroid Profile. in Schanzer, et. al., (eds), Recent Advances In Doping Analysis (8), Koln, 2000

*** Codul Mondial Anti-Doping, Lista Interzisa, 2007

*** Standardul International pentru Laboratoare, Documentul tehnic AMAD – TD2003IDCR, versiunea 4.0, 2004