 |
 |
 |
 |
SCREENINGUL CORTICOSTEROIZILOR SI AL STEROIZILOR ANABOLICI ANDROGENI SPECIALI PRIN LC/MS/MS CU TRIPLU QUADRUPOL
CS III Valentin POP, CS III Georgeta BICAN, Dr. CS I Mia LAMOR
AGENTIA NATIONALA ANTI-DOPING, Laboratorul de control doping
Cuvinte cheie: LCMS, corticosteroid, steroid anabolic androgen
Rezumat
Scopul lucrarii consta in stabilirea parametrilor adecvati de detectare a corticosteroizilor si steroizilor anabolici androgeni prin cromatografie de lichid cuplata cu spectrometrie de masa in tandem cu triplu quadruopol (LC/MS/MS). Steroizii anabolici androgeni studiati au dat intensitati de semnal acceptabile pe modul de ionizare APCI pozitiv, dar nu si pe APCI negativ; corticosteroizii, cu exceptia desoxycortonei au fost identificati in modul de ionizare APCI negativ.
Lucrarea descrie o metoda screening simpla si sensibila pentru 18 corticosteroizi, 5 steroizi anabolici androgeni si 4 inhibitori de aromataza prin cromatografie de lichid cuplata cu spectrometria de masa in tandem cu triplu quadrupol. Metoda poate detecta corticosteroizii si steroizii anabolici androgeni la o concentratie de 10ng/ml, sub nivelul de performanta minim cerut de Agentia Mondiala Antidoping, care este 30ng/ml pentru corticosteroizi, respectiv 10ng/ml pentru steroizii anabolici androgeni.
Introducere
Corticosteroizii sunt o clasa de substante medicamentoase utilizata uneori in mod abuziv de catre sportivi. Corticosteroizii sunt substante foarte active in tratamentul inflamatiilor si astmului. Corticosteroizii descresc durerea si cresc abilitatea atletului de a se concentra in competitiile de forta sau de rezistenta [1].
Steroizii anabolici androgeni sunt hormoni cu structura steroidica care stimuleaza sinteza proteinelor si au ca efect cresterea masei musculare si grabesc recuperarea dupa efort sau accidentari [3].
Reglementarile antidoping interzic utilizarea steroizilor anabolici androgeni, indiferent de calea de administrare, in timp ce utilizarea corticosteroizilor este doar restrictionata. Administrarea sistemica a corticosteroizilor este interzisa in orice circumstante insa pot fi permise injectiile locale si intraarticulare sau preparatele dermatologice, daca se dovedesc a fi necesare din punct de vedere medical. Administrarea corticosteroizilor in scopuri medicale trebuie precedata de obtinerea unei scutiri pentru uz terapeutic de la forul competent [6].
Datorita unor particularitati structurale, unii steroizi anabolici androgeni (ca trenbolonul sau tetrahidro-gestrinona), precum si corticosteroizii sunt analizati prin cromatografie de lichid cuplata cu spectrometrie de masa [2].
Dotarea cu un echipament performant, cromatograf de lichide de inalta presiune cuplat cu un spectrometru de masa in tandem, cu triplu quadrupol, LC/MS/MS Varian 1200L, a permis specialistilor din laboratorul de control doping utilizarea unei tehnici analitice de inalta sensibilitate si selectivitate, ideala pentru analiza corticosteroizilor si a steroizilor anabolici androgeni greu de identificat prin GC/MS [5].
Lucrarea descrie o metoda screening simpla si sensibila pentru 18 corticosteroizi, 5 steroizi anabolici androgeni si 4 inhibitori de aromataza prin LC/MS/MS.
Materiale si metode
Metoda a fost dezvoltata pe solutii etalon de corticosteroizi si steroizi in concentratie de 10ppm. Standardele au fost procurate de la Sigma-Aldrich, beta-glucuronidaza din E. Coli K12 de la Roche Diagnostics, Germania, iar apa ultrapura a fost obtinuta utilizand sistemul de filtrare Simplicity 185, Millipore, Marea Britanie.
Prelucrare probe
Proba de urina se prelucreaza, in paralel, pentru analiza prin LC/MS/MS si GC/MS [4]. Probele au fost prelucrate utilizand o metoda de prelucrare prin hidroliza enzimatica la pH 7 urmata de extractie lichid-lichid cu eter la pH 9; stratul eteric este separat in doua esantioane: unul pentru analiza LC/MS/MS, celalalt pentru analiza GC/MS. Esantionul pentru LC/MS/MS este evaporat, iar reziduul reluat cu amestec metanol:apa 4:1. Proba este injectata in LC/MS/MS de doua ori, o data in modul de ionizare pozitiv, o data in modul de ionizare negativ.
 |
Parametrii analitici
Analiza a fost efectuata pe echipamentul LC/MS/MS VARIAN 1200L, folosind o coloana OmniSpher 3 C18 (100 x 2,0mm diametru intern, dimensiune particule 3microm).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rezultate si discutii
Stabilirea parametrilor mass-spectrometrici ai fiecarei substante s-a realizat utilizand solutii de concentratie 10ppm, solutii preparate in amestec 20% solvent A si 80% solvent B. Solutiile respective au fost injectate direct prin interfata APCI in spectrometrul de masa la un debit constant de 0,05mL/min.
Ionul parinte s-a stabilit din "parent scan":
Tranzitiile MS/MS precursor>produs caracteristice si energiile de coliziune la care acestea prezinta abundenta maxima s-au obtinut prin utilizarea procedurii automate "MS/MS breakdown".
In modul de ionizare negativ, unde intensitatile semnalelor date de aductii de acetat ai corticosteroizilor si produsii de fragmentare secundara ai acestora au fost relativ mari, detectorul a fost setat pe valoarea standard 1500V („standard gain").
In modul de ionizare pozitiv, in care intensitatile semnalelor date de steroizii anabolici androgeni au fost relativ mai mici, detectorul a fost setat pe 1800V („high gain").
Pentru majoritatea compusilor urmariti in acest screening, s-a optat pentru monitorizarea a doua tranzitii MS/MS caracteristice; pentru formebolon, trenbolon si epioxandrolon, a caror detectie la concentratii scazute poate fi problematica, s-a optat pentru monitorizarea a trei tranzitii; pentru standardele interne si pentru corticosteroizii endogeni, cortizonul si hidrocortizonul, s-a considerat suficienta monitorizarea unei singure tranzitii MS/MS caracteristice.
In stabilirea gradientului HPLC (cromatografie de lichid de inalta presiune), s-a acordat atentie separarii perechilor de compusi cu una sau mai multe tranzitii caracteristice comune: fluorometolonul si desoximetazona, triamcinolon acetonidul si flunisolidul, prednisolonul si cortizonul. De asemenea, s-a urmarit separarea optima a picurilor formebolonului, trenbolonului si epioxandrolonului de unele interferente ale matricei biologice.
Pentru confirmarea unei probe pozitive, aceasta va fi reinjectata pe o metoda LC/MS/MS in care sunt monitorizate, conform Standardului pentru Laboratoare, cel putin 3 tranzitii specifice substantei detectate in screening si o tranzitie specifica standardului intern. Astfel, pentru dexametazona, dupa studierea spectrului de masa obtinut in urma disocierii moleculare a ionului parinte in celula de coliziune, tranzitiile selectate sunt: (-)451.2>361 +19; (-)451.2>307 +33; (-) 451.2>325 +35; (-)451.2>292 +41 plus (-)435,2>355 +16,0 pentru standardul intern.
In tabelele 1 si 2, sunt prezentate substantele analizate, timpii de retentie corespunzatori, tranzitiile specifice la energiile de coliziune stabilite pentru fiecare precursor>produs in parte.
In figurile 1 si 2, sunt prezentate cromatogramele LC/MS/MS a unui amestec de standarde.
Tabelul 11Parametrii analitici ai corticosteroizilor in analiza screening prin LC/MS/MS
|
Tabelul 2
Parametrii analitici ai steroizilor anabolici androgeni in analiza screening prin LC/MS/MS
|
 |
 |
Concluzii
Metoda de analiza dezvoltata in Laboratorul de control doping este simpla si sensibila, cromatograful de lichide cuplat cu un spectrometru de masa in tandem cu triplu quadrupol dovedindu-se un instrument eficace pentru analizele de control doping.
Selectivitatea monitorizarii reactiilor multiple si folosirea unei coloane HPLC eficiente permite detectarea simultana a 17 corticosteroizi in modul de ionizare negativ si a 5 steroizi anabolici androgeni, 4 inhibitori de aromataza si 1 corticosteroid in modul de ionizare pozitiv, intr-o singura analiza.
Metoda poate detecta corticosteroizii si steroizii anabolici androgeni la o concentratie de 10ng/ml, sub nivelul de performanta minim cerut de Agentia Mondiala Antidoping, care este 30ng/ml pentru corticosteroizi, respectiv 10ng/ml pentru steroizii anabolici androgeni.
Monitorizarea simultana a mai multor tranzitii pentru acelasi compus permite confirmarea indubitabila a prezentei corticosteroizilor, steroizilor anabolici androgeni si inhibitorilor de aromataza si asigura un control doping eficient.
Abstract
The scope of the paper work is to establish the adequate parameters for corticosteroids and anabolic androgenic steroids detection through liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry with triple quadrupole (LC/MS/MS). Anabolic androgenic steroids studied gave acceptable signal intensities on positive ionization APCI mode but not on negative APCI; corticosteroids, except for desoxycortone have been identified in negative ionization APCI mode.
The paper work describes a simple and sensible screening method for 18 corticosteroids, 5 anabolic androgenic steroids and 4 inhibitors of aromatize, by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry with triple quadrupole. The method may detect corticosteroids and anabolic androgenic steroids to a concentration of 10ng/ml, under the minimum performance level required by World Anti-Doping Agency, which is 30ng/ml for corticosteroids, respectively 10ng/ml for anabolic androgenic steroids.
Bibliografie
CUMMISKEY, J., Glucocorticosteroids in Doping in Sport. In: Concerted Action in the Fight Against Doping in Sport (CAF-DIS), Dublin, 2002
DEVENTER, K.; DELBEKE, F.T., Validation of a screening method for corticosteroids in doping analysis by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. In: Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003; 17: 2107-2114
HARDMANN, J. G.; LIMBIRD, E. J., The Pharmacological Basis of Therapeutics (9th edn.). New Zork, 1996
MARECK, U.; THEVIS, M.; GUDDAT, S.; GOTZMANN, A.; BREDEHOFT, M.; GEYER, H.; SCHANZER, W., Comprehensive sample preparation for anabolic steroids, glucocorticosteroids, beta-receptor blocking agents, selected anabolic androgenic steroids and buprenorphine in human urine. In: Recent Advances in Doping Analyses (12). Sport und Buch Strauß, Koln (2004), 65-68
P0P, V.; VAJIALA, G.; LAMOR, M.; BICAN, G.; TONE, M., Comparative analytical techniques for the identification of some androgenic anabolic steroids (GC/MS – LC/MS/MS). In: Recent Advances in Doping Analyses (13), Sport und Buch Strauss, Koln (2005), 369-374
WADA 2006 Prohibited List – International standard
