 |
 |
 |
 |
VERIFICAREA HIDROLIZEI ENZIMATICE IN PROCESUL DE PRELUCRARE A PROBELOR IN CONTROLUL DOPING
Dr. Mia LAMOR, Drd. CS III Ileana VAJIALA
AGENTIA NATIONALA ANTI-DOPING, Laboratorul de control doping
Cuvinte cheie: hidroliza enzimatica, profil steroidic, steroizi anabolici androgeni
Rezumat
Steroizii anabolici androgeni (SAA) sunt excretati in urina in forma conjugata, ceea ce ridica probleme semnificative in analiza acestor compusi interzisi sportivilor prin reglementarile internationale in domeniul controlului doping. Scindarea conjugatilor in timpul analizei se face enzimatic si presupune ruperea completa a legaturii glicozidice si eliberarea androgenilor biologic activi, extrasi apoi cu solventi nepolari si derivatizati pentru analiza GC/MS. Timpul necesar unei hidrolize complete variaza pentru diferitii steroizi conjugati iar hidroliza incompleta duce la modificari ale profilului steroidic, element important in luarea deciziilor in controlul doping. Lucrarea si-a propus stabilirea timpului optim de realizare a hidrolizei enzimatice pentru deconjugarea completa a tuturor steroizilor prezenti, precum si influenta duratei procesuli asupra profilului hormonal. Ca etapa critica in analiza SAA am stabilit modalitatea controlului hirolizei in analiza curenta prin folosirea standardelor interne deuterate.
Introducere
O conditie fundamentala pentru implementarea unei metode GC/MS selective si specifice pentru steroizi este cunoasterea completa a metabolismului si a profilului excretiei urinare, atat la steroizii anabolici cat si la hormonii endogeni de natura steroidica.
Profilul steroidic este utilizat de endocrinologi pentru detectia unor deficiente enzimatice la nivelul caii de metabolizare a steroizilor. Utilizarea sa in controlul doping a fost promovata de Donike, in special in detectarea abuzului de testosteron exogen [1, 2, 3]. Cei mai importanti parametri ai profilului steoidic sunt testosteronul (T), epitestosteronul (EPIT), 3α-androstandiolul, androsteronul (AND), etiocolanolonul (ETIO), dehidrotestosteron (DHT), 5 α-diolul, 5β-diolul si pregnandiol. Acesti parametri sunt destul de stabili si putin influentati de antrenament, ritm cardiac, ciclu menstrual si ritm anual, dar pot fi influentati de factori precum: ingerarea de alcool, administrarea hormonilor exogeni, activitate bacteriana dezvoltata in probe sau hidroliza incompleta in procesul de prelucrare la analiza probelor de control doping [2, 4].
Ca si alti steroizi, androgenii sunt predominant excretati in urina sub forma conjugata, solubila in apa. Conjugarea este o etapa importanta in catabolismul steroizilor, ea avand loc prin substituirea unei grupari hidroxil din pozitia 3 sau 17 cu un radical sulfat sau glucuronat, la nivelul ficatului, aceasta faza fiind o modalitate de a obtine derivati solubili, usor de transportat si de eliminat din organism. Reactia de glucuronoconjugare necesita acidul uridin difosfoglucuronic (UDPGA) si enzima glucuroniltransferaza, cand are loc atasarea acidului glucuronic la o grupare hidroxilica a moleculei steroidice:
 |
Glucuronidarea steroizilor la inelul A are loc in pozitia 3alfa-hidroxi, configuratie produsa in urma reducerii grupei 3-ceto, iar la inelul D glucuronidarea are loc la gruparea 17-hidroxi, asa cum este prezentat spre exemplificare pentru metandienona (figura 1) [5, 6, 7].
 |
Excretia urinara in forma glucurono- sau sulfo-conjugata, solubila in apa, inactiva biologic, ridica probleme semnificative in analiza compusilor steroidici. In general, scindarea conjugatilor se face enzimatic sau prin solvoliza [8].
Metodele descrise in literatura pentru screening-ul si confirmarea steroizilor anabolici endogeni si exogeni includ o etapa foarte importanta in procedura de extractie din probele biologice de urina, si anume hidroliza enzimatica care presupune ruperea completa a legaturii glicozidice si eliberarea androgenilor biologic activi, ce pot fi apoi extrasi cu solventi nepolari in vederea analizei GC/MS ca derivati trimetilsililati [2, 8-10].
Efectuarea hidrolizei direct asupra probei de urina implica o serie de probleme in analiza: hidroliza incompleta a unor conjugati, activitate diferita a unor enzime, inactivarea enzimei de catre diferiti inhibitori etc. S-a observat ca cea mai eficienta enzima pentru scindarea steroizilor anabolizanti excretati sub forma conjugata este beta-glucuronidaza din E. Coli la 50°C, temperatura optima de activitate a enzimei [2, 10, 11].
Hidroliza incompleta a hormonilor androgeni conjugati in timpul analizei poate induce modificari in profilul steroidic, in sensul unor concentratii mai mici de AND si ETIO si concentratii mai mari de testosteron si epitestosteron [2, 9].
In cadrul acestei lucrari, ne-am propus sa stabilim durata optima a etapei de hidroliza si parametrii prin care acest proces poate fi controlat in analiza curenta de control doping. De asemenea, am studiat influenta duratei hidrolizei enzimatice asupra profilului hormonal in ansamblul sau.
Materiale si metoda
Materiale
Pentru controlul hidrolizei enzimatice, am folosit standardul [2,2,4,4-2H4] androsteron glucuronat (AND glucuronat deuterat), procurat de la Laboratorul National de Standarde Analitice din Australia (NARL), si un amestec de standarde interne deuterate (SID) sintetizat de Laboratorul de control doping din Koln. Acest amestec contine, printre alti compusi, si [2,2,4,4,-2H4] etiocolanolon (ETIO deuterat) in concentratie de 50microg/ml. Hidroliza s-a efectuat cu enzima -glucuronidaza din E.coli, de provenienta Roche Diagnostics, Mannheim, Germania.
Prelucrarea probelor
S-au investigat probe de urina negative. In fiecare proba, s-au adaugat cate 20microl AND glucuronat deuterat de concentratie 50microg/ml si 20microl amestec SID. Probele astfel pregatite au fost supuse extractiei pentru steroizii anabolici androgeni, fractii combinate, in acord cu procedura elaborata si optimizata in cadrul Laboratorului de control doping al Agentiei Nationale Anti-Doping [3, 12]. Dupa extractia lichid-lichid, s-a practicat hidroliza enzimatica cu 25microl enzima beta-glucuronidaza din E.coli si incubare timp de 5, 15, 60 si respectiv 90 de minute in block-heater la 50˚C. Extractele evaporate si uscate s-au derivatizat cu 100microl amestec de derivatizare MSTFA:NH4I:etantiol (100:2:3; v:w:v) prin incalzire 20min. la 60˚C.
Analiza GC/MS
Un volum de 3microl din extractul derivatizat s-a injectat in sistemul GC/MS Agilent Technologies 6890N/5973Network, MS-02, cu coloana capilara HP ULTRA 1: 17m x 0,2mm x 0,11m. Gazul purtator a fost heliu (debit 0,8ml/min) iar injectarea s-a facut in modul split 1:10. Temperatura injectorului a fost de 300˚C si s-a lucrat cu urmatorul program de temperatura: 160˚C (2min), 5˚C/min; 255˚C, 30˚C/min; 285˚C (5min), 60˚C/min; 300˚C (3,75min).
In modul de lucru SIM (monitorizarea ionului selectat), s-au achizitionat fragmentele ionice caracteristice fiecarui hormon androgen, precum si compusilor deuterati utilizati, ioni care au fost folositi si in determinarea cantitativa a acestor compusi.
Mentionam ca in cadrul Laboratorului de control doping s-a elaborat o tehnologie de cuantificare [12] pe baza curbelor de calibrare a 12 hormoni androgeni si a fost creat un program software care calculeaza si editeaza toti parametrii corespunzatori compusilor de interes: ionii monitorizati, timpul de retentie (TR), aria semnalului, concentratia (ng/mL proba), precum si raportul concentratiilor diferitilor compusi (figura 2). Pentru fiecare proba analizata, se determina astfel profilul steroidic, element important in luarea unei decizii corecte in controlul doping efectuat la sportivi.
Rezultate si discutii
Timpul necesar unei hidrolize enzimatice complete variaza pentru diferitii steroizi conjugati. Din studiile efectuate asupra profilului steroidic [9], se cunoaste faptul ca androsteronul si etiocolanolonul sunt hormonii steroidici endogeni care se excreta renal in mod normal in concentratia cea mai mare (aprox 1000 ng/ml), necesitand, din acest motiv, un interval mai indelungat pentru hidrolizarea completa.
In aceasta lucrare, pentru optimizarea si controlul procesului hidrolizei enzimatice, am folosit echivalentele deuterate ale compusilor mai greu hidrolizabili, unul in forma conjugata (D4-AND-glucuronat) si celalalt liber (D4-ETIO). In procesul de prelucrare a probelor, numai deuteratul glucuronat a hidrolizat, astfel incat in cromatograme sunt prezente semnale caracteristice deuteratilor de androsteron si etiocolanolon. Fiind izomeri de pozitie, cei doi compusi au aceeasi masa moleculara si spectru de masa (pic de baza m/z 438), diferentiindu-se doar prin timpii de retentie cromatografica (fig. 3).
Asa cum se observa in figura 3 A si B, semnalele foarte mici obtinute pentru D4-androsteron conduc la ideea ca hidroliza enzimatica este incompleta dupa 5 si respectiv 15min. O crestere a timpului de incubare de la 60 la 90min (figura 3 C, D) nu produce modificari ale inaltimii semnalului compusului D4-Androsteron, cei doi compusi mentinandu-se in raport de aproximativ 1:2.
In tabelul 1, sunt prezentati comparativ compusii principali care descriu profilul steroidic al aceleiasi probe, la timpi diferiti de incubare in etapa de hidroliza enzimatica.
Valorile concentratiilor sunt calculate dupa programul software pentru profil hormonal, exemplificat in figura 2, pentru proba de urina supusa hidrolizei enzimatice timp de 60 min. Din tabel, se poate observa cresterea semnificativa a concentratiilor cu cresterea timpului de incubare, si anume de la 259,9 ng/mL la 3441,4 pentru androsteron si respectiv de la 611,7 ng/mL la 2907ng/mL pentru etiocolanolon. Pentru ceilalti hormoni studiati (DHEA, T, E), valorile concentratiilor nu sunt influentate de timpul de efectuare a hidrolizei, deoarece concentratia lor in urina este mica si, in consecinta, nici valorile raportului T/E nu prezita modificari. Prin incubarea timp de 90 min a probelor, nu se observa modificari esentiale in concentratia endogenilor caracteristici profilului, fata de timpul de hidroliza de 60 min.
Tabelul 1
Valorile principalilor parametri ai profilului hormonal in functie de timpul hidrolizei enzimatice
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 |
 |
 |
 |
 |
 |
Concluzii
Ca urmare a cercetarilor efectuate, durata optima de realizare a hidrolizei enzimatice este de 60 minute, timp de incubare care permite deconjugarea completa a tuturor compusilor steroidici prezenti.
Adrosteronul si etiocolanolonul sunt afectati semnificativ de timpul de realizare a hidrolizei enzimatice, deoarece se gasesc in organism in concentratia cea mai mare.
Concentratia testosteronului si epitestosteronului sunt relativ constante la durate diferite ale hidrolizei enzimatice.
Ca etapa critica a analizei steroizilor anabolici androgeni, este necesar controlul hidrolizei enzimatice in analiza curenta de control doping. Folosirea standardelor interne deuterate ofera posibilitatea monitorizarii la fiecare proba a raportului deuteratilor de androsteron si etiocolanolon prin editarea ferestrei pentru controlul vizual rapid al hidrolizei.
Abstract
Anabolic androgenous steroids (AAS) are excreted in urine in conjugated form, which raises significant issues in the analysis of these compounds, prohibited to the athletes through the international rules for doping control. The cleavage of the conjugates during analysis is made enzymatically and implies the complete brake up of the glicozidic bond and the release of active biological AAS, extracted afterwards with nonpolar solvents and derivatized for GC/MS analysis.
The needed time for a complete hydrolysis varies for different conjugated steroids and an incomplete hydrolysis leads to changes of steroidic profile, an important element in the decision making process in doping control. This paper work intends to establish the optimum time for the enzymatic hydrolysis till complete de-conjugation of all steroids present in a urine sample, as well as the influence of this process' duration over steroidic profile. As a critical step in AAS analysis, we have also established the way of hydrolysis control in routine work through the use of deuterated internal standards.
Bibliogarafie
1. DONIKE, M.; GEYER, H.; GOTZMANN, A.; KRAFT, M.; MANDEL, F.; NOLTEERNSTING, E.; OPFERMANN, G.; SIGMUND, G.; SCHANZER, W.; ZIMMERMANN, J., Dope Analysis. Official Proceedings of the International Athletic Fundation World Symposium on Doping in Sport, Florence, 10-12 May 1987, pp 53-80
2. GEYER, H., SCHANZER, W.; MARECK-ENGELKE, U.; DONIKE, M., Factors Influencing the Steroidic Profile. In: Recent Advances in Doping Analysis (3), Koln, Ed. Sport und Buch Strau, 1996, pag. 95-114
3. VAJIALA,G.,E.; LAMOR,M., Doping Antidoping. Bucuresti, Ed. FEST, 2002.
4. VAJIALA, G.; LAMOR, M.; MIHAILESCU, R.; EFSTADIADE, D.,Cercetari farmacologice privind influenta utilizarii steroizilor anabolizanti asupra profilului hormonilor androgeni excretati renal. Referat de sinteza, Bucuresti, INCS, 1996, pp 6-11
5. LAMOR, M., Studiul raporturilor dintre diferite substante din grupa steroizilor anabolici androgeni si al eliminarii lor din organism. Teza de doctorat, Universitatea Bucuresti, Bucuresti, 2000
6. SCHANZER, W., Metabolism of Anabolic Androgenic Steroids: 5α- and 5β-Reduction of 3-Keto-4-ene Steroids. In: Recent Advances in Doping Analysis (4), Koln, Ed. Sport und Buch Strauss, 1997, pag. 185-201
7. VAJIALA, G., E.; DUMITRU, I., F., Degradation of Testosterone and Synthesis Anabolic Androgenic Steroids in the Human Organism. In: J. Med. Biochem., 2 (1) (1998) 3
8. SANAULLAH; BOWERS, L., D., Direct Measurement of Testosterone and Epitestosterone Glucuronates and Sulfates with HPLC/MS and HPLC/MS/MS. In: Recent Advances in Doping Analysis (3), Koln, Ed. Sport und Buch Strauss, 1996, pag. 271-275
9. VAJIALA, G., Actiunea steroizilor anabolizanti asupra metabolismului hormonilor androgeni. Teza de doctorat. Universitatea Bucuresti, Facultatea de Biologie, Bucuresti, 1998
10. HABER, E.; MUNOZ-GUERRA, J.; SORIANO, C.; CARRERAS, D.; RODRIGUEZ, C.; RODRIGUEZ, F. A., Automated Preparation for Screening of Anabolic Steroids in Urine in HP 7686 PrepStation System. In: Recent Advances in Doping Analysis (7), Koln, Ed. Sport und Buch Strau, 1999, pag. 341-346
11. GEYER, H.; SCHANZER, W.; MAREK-ENGELKE, U.; NOLTEERNSTING, E; OPFERMANN, G., Screening Procedure for Anabolic Steroids – The Control of the Hydrolisis with Deuterated Androsterone Glucuronide and Studies with Direct Hydrolisis. In: Recent Advances in Doping Analysis (5), Koln, Ed. Sport & Buch Strau, 1998, pag. 99-101
12. GRAZIELA ELENA VAJIALA (coordonator), Analiza substantelor interzise in sport. Bucuresti, Edit. Renaissance, 2006
